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细胞乙醛脱氢酶2 活性比色法定量检测试剂盒产品说明书

 发布时间:2017-01-10 点击量:789


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细胞乙醛脱氢酶2 活性比色法定量检测试剂盒产品说明书
主要用途
细胞乙醛脱氢酶2 活性比色法定量检测试剂盒是一种旨在使用乙醛脱氢酶2 敏感性抑制剂,通过检测反应
系统中氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)还原后峰值的增高,即采用比色法来测定细胞裂解萃取液样
品中酶活性的而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。其适用于各种
细胞包括胚胎干细胞、神经干细胞等裂解悬液样品(动物、人体等)乙醛脱氢酶2 的特异活性检测。产品
严格无菌,即到即用,操作简捷,性能稳定。
技术背景
乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase;ALDH;EC1.2.1.3),又称为乙醛NAD氧化还原酶(aldehyde NADoxidoreductase)
是一类NAD(P)依赖性酶,催化广谱的外源性或内源性脂肪族和芳香族乙醛类底物氧化,
包括乙醇、氨基酸、生物胺(biogenic amine)、维生素、固醇类、脂质、药物和环境分子等代谢产物。乙醛
脱氢酶是乙醇在体内分解代谢过程中两种主要酶之一。乙醛脱氢酶把乙醛中的两个氢原子脱掉,使乙醛转
化为乙酸,生成的乙酸进入脂肪酸氧化途径,终被氧化成二氧化碳和水。乙醛脱氢酶主要有两种同工酶:
ALDH1和ALDH2。ALDH1存在于胞液中,ALDH2存在于线粒体中,ALDH2比ALDH1的活性高。乙醛脱氢酶
的缺少,使酒精不能被完全分解为水和二氧化碳,而是以乙醛继续留在体内,使人喝酒后产生恶心欲吐、
昏迷不适等醉酒症状。基于来自于乙醇代谢产生的乙醛(acetaldehyde),在7-羟基-3-(4-羟苯基)-异黄酮
-7-糖苷(Daidzein-7-O-β-D-glucopyranoside;Daidzin)存在与否的情况下,由乙醛脱氢酶2的催化作用,转
化为乙酸(acetic acid)产物后,通过测定反应体系中氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(oxidized reduced
nicotinamide adenine dinucleotide;NAD)转化为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced nicotinamide adenine
dinucleotide;NADH)的变化(340nm 波长),来定量分析乙醛脱氢酶2的特异活性。乙醛脱氢酶2反应系
统为:
ALDH
CH3OH + NAD+ + H2O → CH3COOH + NADH + H+
Daidzin
产品内容
清理液(Reagent A) 毫升
裂解液(Reagent B) 毫升
缓冲液(Reagent C) 毫升
反应液(Reagent D) 毫升
底物液(Reagent E) 毫升
阴性液(Reagent F) 毫升
专性液(Reagent G) 微升
产品说明书1 份
保存方式
保存缓冲液(Reagent C)、反应液(Reagent D)、底物液(Reagent E)和专性液(Reagent G)在-20℃冰
箱里;其余的保存在4℃冰箱里;反应液(Reagent D)和底物液(Reagent E)避免光照;有效保证6 月
用户自备
1.5 毫升离心管:用于样品保存的容器
15 毫升锥形离心管:用于样品制备的容器
细胞刮脱棒:用于脱离贴壁细胞
(微型)台式离心机:用于样品制备
比色皿或酶标板:用于比色的容器
分光光度仪或酶标仪:用于比色分析
实验步骤
实验开始前,将-20℃冰箱里的试剂盒中的裂解液(Reagent B)置入冰槽里预冷。然后进行下列操作。
一、样品准备
1. 准备好25cm2 细胞培养瓶或60mm 细胞培养皿的待测培养细胞(1 至5 X 106 细胞)
2. 小心加入xx 毫升清理液(Reagent A),覆盖生长表面
3. 小心抽去清理液
4. 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞(注意:可以使用胰酶消化)
5. 加入xx 毫升清理液(Reagent A),混匀细胞
6. 移入到预冷的15 毫升锥形离心管(注意:悬浮细胞从这一步骤开始)
7. 放进4℃台式离心机离心5 分钟,速度为300g
8. 小心抽去上清液
9. 加入xx 微升裂解液(Reagent B),充分混匀
10.转移到预冷的1.5 毫升离心管
11.强力涡旋震荡15 秒
12.置于冰槽里孵育30 分钟
13.放进4℃微型台式离心机离心5 分钟,速度为16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415)
14.小心移取500 微升上清液到新的预冷的1.5 毫升离心管
15.移取10 微升进行蛋白定量检测(注意:建议使用Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒-30030.1)
1. 即刻放进-70℃保存或置于冰槽里继续后续操作
二、测定准备
1. 开启并设定好分光光度仪(温度为25℃):波长340nm,间隔60 秒,读数5 次(共5 分钟),并置零
2. 从-20℃冰箱里取出试剂,置于冰槽里融化;底物液(Reagent E)避免光照;缓冲液(Reagent C)
置于室温下均衡温度
三、背景对照测定
1. 移取xx 微升缓冲液(Reagent C)到新的比色皿
2. 加入xx 微升反应液(Reagent D)
3. 加入xx 微升底物液(Reagent E)
4. 在25℃温度下孵育3 分钟
5. 加入xx 微升阴性液(Reagent F)
6. 上下倾倒数次,混匀(限定在3 秒之内)
7. 即刻放进分光光度仪检测,此为背景空对照(5 分钟读数-0 分钟读数)
四、样品总活性测定
1. 移取xx 微升缓冲液(Reagent C)到新的比色皿
2. 加入xx 微升反应液(Reagent D)
3. 加入xx 微升底物液(Reagent E)
4. 在25℃温度下孵育3 分钟
5. 加入20 微升待测样品(或50 微克蛋白)(注意:样品须清澈)
6. 上下倾倒数次,混匀(限定在3 秒之内)
7. 即刻放进分光光度仪检测,此为样品读数(5 分钟读数-0 分钟读数)
五、样品非特异活性测定
1. 移取xx 微升缓冲液(Reagent C)到新的比色皿
2. 加入xx 微升专性液(Reagent G)
3. 加入20 微升待测样品(或50 微克蛋白)(注意:样品须清澈)
4. 上下倾倒数次,混匀
5. 在25℃温度下孵育10 分钟
6. 加入xx 微升缓冲液(Reagent C)
7. 加入xx 微升反应液(Reagent D)
8. 加入xx 微升底物液(Reagent E)
9. 上下倾倒数次,混匀(限定在3 秒之内)
10.即刻放进分光光度仪检测,此为样品读数(5 分钟读数-0 分钟读数)
六、计算样品活性
1)样品活性(总活性或非特异活性)
【(样品读数-背景读数)X 1(体系容量,毫升)X 样品稀释倍数】÷【0.02(样品容量,毫升)X 6.22(毫
摩尔吸光系数X 5(反应时间,分钟)】=单位/毫升÷(样品蛋白浓度)毫克/毫升=单位/毫克
单位=微摩尔NAD/分钟
2)样品特异活性
样品总活性测定-样品非特异活性测定=样品特异活性
七、酶标板测定
1. 背景对照和样品总活性
1. 在96 孔酶标板上做好相应标记:背景对照、样品总活性
2. 分别移取xx 微升缓冲液(Reagent C)到96 孔板中
3. 分别加入xx 微升反应液(Reagent D)
4. 分别加入xx 微升底物液(Reagent E)
5. 在25℃温度下孵育3 分钟
6. 分别加入xx 微升阴性液(Reagent F)或待测样品(或10 微克蛋白)到相应孔中(注意:样品须清澈)
7. 轻轻摇动酶标板
8. 即刻放进酶标仪检测:0 分钟读数和5 分钟读数
2. 样品非特异活性
1. 在96 孔酶标板上做好相应标记:样品非特异活性
2. 移取xx 微升缓冲液(Reagent C)到96 孔板中
3. 加入xx 微升专性液(Reagent G)
4. 加入5 微升待测样品(或10 微克蛋白)(注意:样品须清澈)
5. 轻轻摇动96 孔酶标板
6. 在25℃温度下孵育10 分钟
7. 加入xx 微升缓冲液(Reagent C)
8. 加入xx 微升反应液(Reagent D)
9. 加入xx 微升底物液(Reagent E)
10. 轻轻摇动酶标板
11. 即刻放进酶标仪检测:0 分钟读数和5 分钟读数
3. 计算样品活性
1)样品活性(总活性或非特异活性)
[(样品读数-背景读数)X 样品稀释倍数X 0.25(毫升,测定容量)]÷[0.005(样品容量,毫升)X 6.22
(毫摩尔吸光系数)X 0.6(厘米)X 5(分钟)]=单位/毫升÷(样品蛋白浓度)毫克/毫升=单位/毫克
单位=微摩尔NAD/分钟
2)样品特异活性
样品总活性测定-样品非特异活性测定=样品特异活性
注意事项
1. 本产品为20 次(比色皿;10 个样本)和80 次(酶标板;40 个样本)操作,包括背景对照
2. 操作时,须戴手套
3. 系统操作过程中,背景测定只需1 次
4. 建议使用比色皿测定
5. 样品须澄清,至关重要
6. 加样后3 秒内比色测定
7. 测定值由低到高变化;测定可持续5 分钟
8. 比色测定后,比色皿须清洗彻底
9. 样本测定5 分钟读数高于0 分钟读数表明具有酶活性
10.建议待测样本蛋白浓度为50 微克/20 微升(本公司提供Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒-30030.1)
11.如果待测样品浓度过高或过低,可以调整样品浓度
12.乙醛脱氢酶2 单位活性定义为:在25℃,pH 8.0 条件下,每分钟内能够转化1 微摩尔氧化型烟酰胺腺
嘌呤二核苷酸(NAD)为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)所需的酶量作为一个活性单位
13.本公司提供系列乙醇代谢酶类检测试剂产品
质量标准
1. 本产品经鉴定性能稳定
2. 本产品经鉴定检测敏感