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细菌琥珀酸脱氢酶(SDH)活性比色法定量检测试剂盒

 发布时间:2017-01-17 点击量:430

YY10103.6 v.A

 

细菌琥珀酸脱氢酶(SDH活性比色法定量检测试剂盒产品说明书

 

主要用途

 

细菌琥珀酸脱氢酶(SDH活性比色法定量检测试剂是一种旨在使用合成电子受体染料通过反应系统测定染料还原后峰值的降低,即采用比色法测算样品中单位酶活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的其适合于各种细菌菌株裂解悬液和膜蛋白样品琥珀酸脱氢酶的特异性活性检测。用于衰老、能量代谢、蛋白组学、发酵分析等研究。产品不含污染性蛋白酶,严格无菌,即到即用,操作简捷,性能稳定,反应优化,检测敏感。

 

技术背景

 

琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase;SDH;EC 1.3.99.1)是三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle;TCA)或Krebs循环中与细胞线粒体膜相关的重要元素,位于线粒体内膜,参与细胞呼吸链。细菌琥珀酸脱氢酶,又称为SdhCDAB,为膜结合性蛋白,分为周边(peripheral)和跨膜(transmembrane)部分,其中周边亲水部分由SdhA和SdhB亚体组成:SdhA亚体含有黄素蛋白(flavoprotein),是琥珀酸的活性部位;SdhB含有铁硫蛋白(iron-sulfur protein),进行电子传递;跨膜疏水部分由SdhC和SdhD亚体组成:SdhC含有亚铁血红素-B(Heme-B),SdhD含有泛醌ubiquinone结合部位(Q部位)。其作用在于参与三羧酸循环(TCA cycle)和呼吸链活动。琥珀酸脱氢酶催化琥珀酸(succinate)的氧化反应,产生延胡索酸(furmarate),通过黄素腺嘌呤二核苷酸(Flavin Adenine Dinucleotide;FAD)传递电子。基于琥珀酸脱氢酶的反应原理,使用人工电子受体染料二氯靛酚钠(2,6-Dichloroindophenol sodium;DCIP),接受来自还原型黄素腺嘌呤二核苷酸(Reduced flavin Adenine Dinucleotide;FADH2)的电子,而被还原,在分光光度仪下,其吸光值(600nm波长)的变化,来测算琥珀酸脱氢酶的活性。其反应方式为:

 

 

产品内容

 

裂解液(Reagent A)    毫升

活性液(Reagent B  微升

缓冲液(Reagent C  毫升

反应液(Reagent D  毫升

底物液(Reagent E    毫升

阴性液(Reagent F  微升

产品说明书  1份

 

 

 

保存方式

 

保存在-20冰箱里,避免反复冻融;反应液(Reagent D)含有毒性物质,避免直接用手接触;底物液(Reagent E),避免光照有效保证3月

 

用户自备

 

15毫升锥形离心管:用于样品操作的容器

1.5毫升离心管:用于样品操作和保存的容器

超声仪:用于裂解细菌细胞

(微型)台式离心机:用于样品操作

恒温水槽或培养箱:用于反应物孵育

比色皿:用于比色测定的容器

分光光度仪:用于比色分析

 

实验步骤

 

实验开始前,将-20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液置入冰槽里融化;底物液(Reagent E注意避光。然后进行下列操作。

 

一、样品准备

 

  • 准备好10毫升待测的细菌放进37摇床孵育16小时,速度为220RPM
  • 直至OD6000.40.8,即12 X 107细胞/毫升
  • 置于冰槽里5分钟
  • 放进4℃台式离心机离心5分钟,速度为1000g
  • 小心抽去上清液
  • 加入xx微升裂解液(Reagent A,充分混匀
  • 转移到预冷的1.5毫升离心管
  • 加入xx微升活性液(Reagent B
  • 强力涡旋震荡15
  • 至于超声仪下超声处理:100功率,20秒超声一次,冰上间隙1分钟,重复3次
  • 放进4℃微型台式离心机离心5分钟,速度为500g
  • 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
  • 移取10微升进行蛋白定量检测(注意:建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒-YY30030.1
  • 即刻放进-70保存或置于冰槽里继续后续操作

 

二、测定准备

 

  • 准备好待测样品,置于冰槽里
  • 设定好分光光度仪(温度为30℃):波长600nm,间隔60秒,读数6次(共5分钟),并置零
  • 缓冲液(Reagent C)室温下均衡温度

 

  • 背景对照测定

 

  • 移取xx微升缓冲液(Reagent C)到新的比色皿
  • 加入xx微升反应液(Reagent D)
  • 加入xx微升底物液(Reagent E)
  • 放进30培养箱里静置3分钟
  • 加入xx微升阴性液(Reagent F)
  • 上下倾倒数次,混匀(限定在3秒之内)
  • 即刻放进分光光度仪检测,此为背景空对照:OD0分钟-OD5分钟 

 

  • 样品活性测定

 

  • 移取xx微升缓冲液(Reagent C)到新的比色皿
  • 加入xx微升反应液(Reagent D)
  • 加入xx微升底物液(Reagent E)
  • 放进30培养箱里静置3分钟
  • 加入100微升待测样品(注意:10微克总蛋白或100微克细总蛋白;样品须溶解
  • 上下倾倒数次,混匀(限定在3秒之内)
  • 即刻放进分光光度仪检测,此为样品活性读数:OD0分钟-OD5分钟

 

  • 计算样品活性

 

 

注意事项

 

  • 本产品为20次操作,包括背景对照测定
  • 操作时,须戴手套
  • 反应液(Reagent D含有毒性物质,避免直接用手接触
  • 系统操作过程中,背景测定只需1次
  • 加入样品后3秒内即刻比色测定
  • 比色测定初始读数(0分钟读数)0.8左右为理想状态
  • 反应1分钟后比色测定值趋于稳定;测定值由高到低变化;测定持续5分钟
  • 测定值由高到低变化,即5分钟测定读数低于0分钟测定读数,表明有酶活性
  • 比色测定后,比色皿须清洗彻底
  • 建议待测样本周膜蛋白浓度为10微克/100微升和细总蛋白浓度为100微克/100微升;如果样本酶活性过低或过高,则可以增加或降低样本量;注意计算公式的调整(本公司提供细菌可溶性膜蛋白制备试剂盒30022.2  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒30030.1)
  • 活性计算时,可以选择5分钟内单位时间大线性变化的吸光值
  • 琥珀酸脱氢酶单位活性定义为:在30℃,pH 7.5条件下,每分钟内能够还原1微摩尔氧化型二氯靛酚钠(DCIP)所需的酶量作为一个活性单位
  • 本公司提供系列琥珀酸脱氢酶技术产品

 

质量标准

 

  • 本产品经鉴定性能稳定
  • 本产品经鉴定检测准确