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精子细胞线粒体DNA 萃取试剂盒

 发布时间:2017-01-18 点击量:139

精子细胞线粒体DNA 萃取试剂盒
产品说明书
主要用途
精子细胞线粒体DNA 萃取试剂是一种旨在通过等密度离心获取动物成熟精子细胞,进而物理破膜,分离
出完整而纯化的线粒体细胞器,然后在生物酶处理下,获得高质量的线粒体DNA 的而经典的技术方
法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适合于各种动物精子细胞的线粒体核酸成分的分离。用于
后续的杂交、克隆、酶切、PCR 分析等。产品即到即用,操作简易,性能稳定,无核酶污染,萃取纯度和
产量皆高。
技术背景
线粒体细胞器的研究是现代细胞生物学的重要的课题之一。线粒体成为生物衰老、古生物、细胞凋亡、
肿瘤、HIV、老年痴呆症、糖尿病、肌肉疾病等研究的主要对象。其中成熟动物精子细胞约有22 至75 个
线粒体,位于精子鞭毛(flagellum)中段(midpiece);提供能量作为精子运动。每个线粒体有50 至75 个
DNA 拷贝数。一旦受精,线粒体DNA 快速降解。精子线粒体DNA 与精子的功能,例如运动和不育密切
相关。如果出现DNA 突变、缺失、含量减少,将会导致弱精子症(Asthenozoospermia)和少弱精子症
(oligoasthenozoospermia)等。
产品内容
高纯液(Reagent A) 毫升
低纯液(Reagent B) 毫升
保存液(Reagent C) 毫升
裂解液(Reagent D) 毫升
破膜液(Reagent E) 毫升
去干扰液(Reagent F) 微升
酶解液(Reagent G) 微升
萃取液(Reagent H) 毫升
浓缩液(Reagent I) 毫升
助沉液(Reagent J) 微升
沉淀液(Reagent K) 毫升
纯化液(Reagent L) 毫升
缓冲液(Reagent M) 毫升
说明书1 份
保存方式
保存裂解液(Reagent D)、去干扰液(Reagent F)、酶解液(Reagent G)、萃取液(Reagent H)和助沉液(Reagent
J)在-20℃冰箱里,其余的保存在4℃冰箱里,有效保证6 月
用户自备
2
1.5 毫升离心管:用于样品操作的容器
15 毫升锥形离心管:用于样品操作的容器
涡旋震荡仪:用于混匀
4℃(微型)台式离心机:用于样品操作
4℃超速离心机:用于样品操作
DOUNCE 匀浆器:用于裂解细胞
58℃恒温水槽:用于孵育反应物
实验步骤
一、样品预处理
1. 移取2 毫升新鲜收集(48 小时内)的精液到2 毫升离心管(注意:建议精子细胞总量为5 X 107)
2. 放进37℃培养箱孵育20 分钟
3. 准备一个15 毫升锥形离心管
4. 加入xx 毫升高纯液(Reagent A)
5. 小心加入xx 毫升低纯液(Reagent B)在上述高纯液(Reagent A)的上面(注意:避免震荡)
6. 小心加入xx 毫升精液在上述低纯液(Reagent B)的上面(注意:避免震荡)
7. 放进台式离心机离心20 分钟,速度为300g
8. 小心移取高纯液(Reagent A)和低纯液(Reagent B)交界面上的精子细胞——此为不成熟精子细胞
(注意:如果检测不成熟精子细胞,可以加入保存液(Reagent C)保留)
9. 小心移取管底精子细胞颗粒群到新的1.5 毫升离心管——此为成熟精子细胞
10.加入xx 毫升保存液(Reagent C),混匀成熟精子细胞颗粒群
11.放进冰槽里孵育20 分钟
12.放进台式离心机离心5 分钟,速度为1000g
13.小心抽去上清液
14.放进冰槽里备用
二、线粒体DNA 分离
1. 加入预冷的xx 毫升裂解液(Reagent D)
2. 涡旋震荡5 秒,充分混匀
3. 即刻放入预冷的DOUNCE 匀浆器
4. 在冰槽里用匀浆棒匀化组织(约20 至40 下)(注意:参考注意事项7)
5. 将所有匀浆物移入15 毫升锥形离心管
6. 放进4℃台式离心机离心10 分钟,速度为1500g
7. 小心移出上清液到另一个新的预冷的15 毫升锥形离心管——此步骤去除细胞核和未溶解的细胞
8. 放进4℃超速离心机离心10 分钟,速度为10000g
9. 小心抽去上清液,保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物(注意:如果暂时停止操作,须暂时放
进-70℃冰箱里)
10.加入xx 微升破膜液(Reagent E)到线粒体颗粒样品中
11.涡旋震荡15 秒,混匀颗粒群
12.转入1.5 毫升离心管
3
13.置入冰槽中孵育15 分钟
14.加入xx 微升去干扰液(Reagent F)
15.用200 微升枪头上下抽吸混匀
16.放进37℃恒温水槽孵育15 分钟
17.加入xx 微升酶解液(Reagent G)
18.涡旋震荡15 秒
19.放进58℃恒温水槽孵育2 小时(注意:可以孵育4 至16 小时,增加萃取产量)
20.置于室温下冷却15 分钟,直至处于室温状态(或置于冰槽里15 至30 秒)
21.加入xx 微升萃取液(Reagent H)(注意:使用前摇匀)
22.涡旋震荡5 秒
23.放进微型台式离心机离心5 分钟,速度为16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415)
24.移出上层液相溶液到新的1.5 毫升离心管(注意:切莫触碰液相交界面上的白色膜状物)
25.加入xx 微升浓缩液(Reagent I)到新的离心管
26.加入xx 微升助沉液(Reagent J)
27.加入xx 微升沉淀液(Reagent K)
28.在涡旋震荡仪上震荡5 秒,充分混匀
29.放进微型台式离心机离心15 分钟,速度为16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415)(注意:离
心前做好方位标记,以便离心后观察管底沉淀颗粒)
30.小心抽掉上清液
31.加入xx 毫升纯化液(Reagent L)
32.放进微型台式离心机离心5 分钟,速度为16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415)
33.小心抽掉上清液
34.空气中晾干沉淀颗粒群
35.加入xx 微升缓冲液(Reagent M)
36.溶解后放进-20℃冰箱长期保存或移出2 微升进行PCR 反应
注意事项
1. 本产品为20 次(5 X 107 精子细胞)操作
2. 操作时,须戴手套
3. 所有操作均须无菌状态下进行,避免污染母液,尤其是裂解液(Reagent D)
4. 线粒体操作均须在4℃或以下状态进行
5. 建议使用足够的样品量
6. 建议严格控制操作时间
7. 通常匀化次数为20 至40 下达到80%的细胞裂解为理想状态。用户可以通过显微镜观察3 微升匀浆物
的细胞裂解程度。低于50%可以增加匀化次数
8. 试剂中的溶液使用前摇匀;酶解液(Reagent G)需放进37℃温育少许;为避免反复冻融,建议适量
分装
9. 可以通过增加线粒体溶解时间(30 分钟)和酶解时间(直至16 小时),获得大量的DNA 产量
10.通常5 X 107 精子细胞中提取的线粒体DNA 达1 至10 微克
11.本公司提供系列线粒体技术产品
质量标准
4
1. 本产品经鉴定性能稳定
2. 本产品经鉴定无核酶污染
3. 本产品经鉴定萃取产量和纯化程度高