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人体hTERT 基因甲基化检测试剂盒

 发布时间:2017-01-18 点击量:164

人体hTERT 基因甲基化检测试剂盒

产品说明书
主要用途
人体hTERT 基因甲基化检测试剂是一种旨在通过化学方法使基因组中的所有胞嘧啶(CYTOSINE)转变成
尿嘧啶(URACIL),而保留了所有甲基化的胞嘧啶,经过甲基化特异性PCR 扩增,探测到人体人体端粒酶
逆转录酶基因hTERT 启动子CpG 岛甲基化信息的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实
验证明的。可以被用于人体人体端粒酶逆转录酶基因hTERT 相关的表观遗传学研究。产品即到即用,性能
稳定,操作简便,转化保证。
技术背景
在基因的启动子区域(promotor region)通常存在一些富含重复双核苷酸“CG”的区域,称为“CpG 岛”(CpG
island)。在人类基因组内,存在有近3 万个CpG 岛。这些CpG 岛不仅是基因的一种标志,而且还参与基
因表达的调控和影响染色质的结构,更是DNA 甲基化的*位置。CpG 岛甲基化形态的扫描分析是基因
表达和表观基因组学的主要课题。人体端粒酶逆转录酶(human omerase reverse transcriptase;hTERT),
又称hTRT、hTCS1 和hEST2,是端粒酶的核心结构,即催化亚体(catalytic subunit)。hTERT 的功能性表
达是端粒酶获得活性的前提。hTERT 可以激活端粒酶,使细胞获得永生化。hTERT 是端粒酶活性的限速决
定成分,其mRNA 表达水平与端粒酶活性之间具有密切的相关性。hTERT 是一单拷贝基因,定位于5q15.33,
属于逆转录酶家族,具有进化上的保守性,序列总长约35kb,由16 个外显子和15 个内含子组成。端粒酶
特异性T-motif 和7 个同源保守序列的RT-motif 分别位于不同的外显子上。hTERTmRNA 还有7 种不同的
剪切转录本,分为缺失型与插入型两类。一旦突变或甲基化,会造成细胞繁殖调控机制缺失,而致肿瘤或
细胞衰老等。
产品内容
缓冲液(Reagent A) 毫升
变性液(Reagent B) 微升
处理液(Reagent C) 毫升
转化液(Reagent D) 毫升
封隔液(Reagent E) 毫升
净化液(Reagent F) 毫升
萃取液(Reagent G) 毫升
浓缩液(Reagent H) 毫升
助沉液(Reagent I) 微升
沉淀液(Reagent J) 毫升
清理液(Reagent K) 毫升
保存液(Reagent L 毫升
扩增液(Reagent M) 微升
补充液(Reagent N) 毫升
U 引物F(Reagent O) 微升
U 引物R(Reagent P) 微升
M 引物F(Reagent Q) 微升
2
M 引物R(Reagent R) 微升
针筒离心柱套
产品说明书1 份
保存方式
保存处理液(Reagent C)、转化液(Reagent D)、助沉液(Reagent I)、扩增液(Reagent M)、补充液
(Reagent N)、U 引物F(Reagent O)、U 引物R(Reagent P)、M 引物F(Reagent Q)和M 引物
R(Reagent R)在-20℃冰箱里; 净化液(Reagent F)和针筒离心柱保存在室温下;其余的保存在4℃
冰箱里; 处理液(Reagent C)和转化液(Reagent D)避免光照;有效保证6 月
用户自备
1.5 毫升离心管:用于样品操作的容器
2.0 毫升离心管:用于样品操作的容器
恒温水槽:用于孵育反应物
微型台式离心机:用于沉淀样品或去除杂质
涡旋震荡仪:用于混匀反应物
真空泵:用于去除样品中的液体成分
针筒挤压塞:用于去除样品中的液体成分
PCR 仪:用于样品扩增
PCR 管或平板:用于PCR 反应的容器
测序试剂盒:用于测序前的产物处理
实验步骤
实验开始前,将处理液(Reagent C)和转化液(Reagent D)从-20℃冰箱中取出,置入室温下。同时
将其中一管缓冲液(Reagent A)置入65℃恒温水槽中预热备用。然后进行下列操作:
一、转化实验
1. 准备1 个2.0 毫升离心管
2. 加入2 微克DNA 样品
3. 加入适量的缓冲液(Reagent A)到50 微升反应体系(注意:不要使用65℃预热的缓冲液(Reagent
A))
4. 加入xx 微升变性液(Reagent B),混匀
5. 放进37℃恒温水槽孵育12 分钟
6. 加入xx 微升处理液(Reagent C)(注意:可见溶液呈现黄色)
7. 在涡旋震荡仪上小心震荡30 秒,充分混匀
8. 加入xx 微升转化液(Reagent D),上下倾倒混匀
9. 加入xx 微升封隔液(Reagent E)
10.放进55℃恒温水槽孵育16 小时
11.小心抽去xx 微升封隔液(Reagent E)
12.加入xx 毫升充分摇匀的净化液(Reagent F),上下倾倒混匀(注意: 净化液(Reagent F)出现沉
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淀,37℃温育后使用)
13.移入到针筒离心柱
14.连接到真空泵,将柱内液体抽去(或使用用户自备的针筒挤压塞挤去柱内液体)
15.加入xx 毫升萃取液(Reagent G)
16.运用真空泵,将萃取液(Reagent G)抽去(或使用用户自备的针筒挤压塞挤去柱内液体)
17.重复实验步骤15 至16 一次
18.去掉针筒,将离心柱放在1.5 毫升离心管
19.放进微型台式离心机离心20 秒,速度为16000g(或13000RPM;例如eppendorf 5415)
20.去掉残余萃取液,更换新的1.5 毫升离心管
21.加入xx 微升65℃预热的缓冲液(Reagent A)到离心柱
22.室温下静置1 分钟
23.放进微型台式离心机离心20 秒,速度为16000g(或13000RPM;例如eppendorf 5415)
24.去掉离心柱
25.加入xx 微升变性液(Reagent B)到离心管,混匀
26.放进37℃恒温水槽孵育12 分钟
27.加入xx 微升浓缩液(Reagent H)
28.加入xx 微升助沉液(Reagent I)
29.加入xx 微升沉淀液(Reagent J)
30.在涡旋震荡仪上震荡30 秒
31.放进微型台式离心机离心15 分钟,速度为16000g(或13000RPM;例如eppendorf 5415)
32.小心抽掉上清液
33.加入xx 毫升清理液(Reagent K)
34.放进微型台式离心机离心5 分钟,速度为16000g(或13000RPM;例如eppendorf 5415)
35.小心抽掉上清液
36.空气中晾干沉淀颗粒群
37.加入xx 微升保存液(Reagent L)
38.放进-20℃冰箱长期保存
二、甲基化特异性PCR
1. 将扩增液(Reagent M)、补充液(Reagent N)、U 引物F(Reagent O)、U 引物R(Reagent P)、
M 引物F(Reagent Q)和M 引物R(Reagent R)从-20℃冰箱里取出
2. 置入冰槽里直至融化
3. 针对一个样本,准备2 个PCR 管,分别标记为U 和M 管
4. 分别移出xx 微升扩增液(Reagent M)到PCR 管里
5. 分别加入1 微升上述转化实验中获得的DNA 样品(总量100 纳克)
6. 分别加入xx 微升U 引物F(Reagent O)和U 引物R(Reagent P)到U 管中
7. 分别加入xx 微升M 引物F(Reagent Q)和M 引物R(Reagent R)到M 管中
8. 再分别加入xx 微升补充液(Reagent N)(反应总量为25 微升)
9. 即刻放进微型台式离心机瞬时离心5 秒,速度为500g(或2000RPM;例如eppendorf 5415)
10.加入50 微升PCR 级矿物油(注意:参见注意事项9)
11.即刻进行热启动PCR 反应:
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12.反应完毕后,移取5 微升进行1.8%琼脂糖凝胶电泳
13.阳性条带:转化后非甲基型(U)――125 bp;转化后甲基型(M)――115 bp
注意事项
1. 本产品为20 次操作
2. 操作时,须戴手套
3. 建议使用带滤芯的枪头,避免污染
4. 一个特定基因的甲基化特异性PCR 通常包括:转化后甲基型(M)、转化后非甲基型(U)
5. 甲基化特异性PCR 的引物设计原则:引物以SENSE 的DNA 链为模板;引物含有足够多的C(后面不
和G 相连);引物含有1-3 个CpG 位点;CpG 位点须在3 端;PCR 片段长度在80-250 碱基
6. U 引物F(Reagent O)、U 引物R(Reagent P)、M 引物F(Reagent Q)和M 引物R(Reagent
R)的信息如下:
7. 通过琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳来检测PCR 扩增后的结果。假如DNA 样品在修饰前是未甲基
化的,那么仅仅“U”Primers 将产生扩增产物;相反,已甲基化的DNA 样品仅仅用“M”Primer 能被扩增
8. 组织样品或杂合子样品常常出现“U”和“M”同时呈现阳性;
9. 根据用户PCR 仪的性能,决定是否加入矿物油(Mineral Oil)
10.必要时,可以调整Tm 温度
11.在-20℃冰箱里储存的产品避免反复冻融
12.转化后的DNA 保存在-20℃冰箱里,避免反复冻融
13.本公司同时提供系列基因甲基化分析试剂产品
14.本公司提供系列甲基化分析试剂产品
质量标准
1. 本产品经鉴定性能稳定
2. 本产品经鉴定转化保证
3. 本产品经鉴定无核酶污染
4.本产品经鉴定反应产量高