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线粒体呼吸链复合物I 活性比色法定量检测试剂盒

 发布时间:2017-01-18 点击量:708

线粒体呼吸链复合物I 活性比色法定量检测试剂盒
产品说明书
主要用途
线粒体呼吸链复合物I(NADH-辅酶Q 还原酶)活性比色法定量检测试剂是一种旨在使用
合成辅酶Q 同功类似物和特异性抑制剂,通过反应系统测定样品中还原型烟酰胺腺嘌呤二
核苷酸(NADH)氧化后峰值的降低,即采用比色法测定样品中酶活性的而经典的技术
方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。其适合于各种纯化线粒体样品(动
物、人体、酵母)以及细胞或组织裂解悬液样品的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)
-辅酶Q 还原酶的特异性活性检测。其用于衰老、能量代谢、蛋白组学、病理生理学、神
经病变等研究。产品不含污染性蛋白酶,严格无菌,即到即用,操作简捷,性能稳定,反应
优化,检测敏感。
技术背景
线粒体呼吸链复合物I,通常称为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸辅酶Q 还原酶(reduced
nicotinamide adeninedinucleotide coenzyme Q reductase;NADH-CoQ reductase),又称为还原
型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶(reduced nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase;
NADH dehydrogenase),是线粒体电子传递链中大的结构成分:含有30 至40 多个多肽结
构。其特征性的酶活性是鱼藤酮敏感的NADH-辅酶Q 还原酶(NADH:Q Reductase)。复
合物I 催化线粒体内电子由供体NADH 传递到内膜上辅酶Q 受体(泛醌;ubiquinone)的能
量转移反应,为整个呼吸链反应系统的*步。基于辅酶Q 底物,在鱼藤酮存在与否的情
况下,通过NADH-辅酶Q 还原酶的催化,转化成还原型泛醌(CoQH2),同时还原型烟酰
胺腺嘌呤二核苷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide;NADH)转化为氧化型烟酰
胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamideadenine dinucleotide;NAD),在分光光度仪下产生吸收峰
值的变化(340nm 波长),由此定量测定NADH-辅酶Q 还原酶的特异活性。其反应系统
是:
产品内容
缓冲液(Reagent A) 毫升
反应液(Reagent B) 毫升
阴性液(Reagent C) 毫升
底物液(Reagent D) 微升
专性液(Reagent E) 微升
说明书1 份
保存方式
保存在-20℃冰箱里,避免反复冻融;反应液(Reagent B)含有毒性物质,避免直接用手
接触;反应液(ReagentB)和底物液(Reagent D),避免光照,有效保证6 月
用户自备
比色皿:用于比色分析的容器
双波长分光光度仪:用于比色分析
培养箱:用于孵育反应物
实验步骤
实验开始前,将-20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液置入冰槽里融化;缓冲液(Reagent A)
室温预热;反应液(Reagent B)和底物液(Reagent D)注意避光。然后进行下列操作。
一、测定准备
1. 准备好待测样品(例如纯化线粒体样品等),置于冰槽里(注意:检测前溶解线粒体;
参见注意事项4)
2. 设定好双波长分光光度仪(温度为30℃):波长分别为340nm 和380nm,间隔30 秒,
读数7 次(共3 分钟),并置零(注意:参见注意事项10)
二、背景对照测定
1. 移取xx 微升缓冲液(Reagent A)到新的比色皿
2. 加入xx 微升反应液(Reagent B)
3. 加入xx 微升底物液(Reagent D)
4. 放进30℃培养箱里静置3 分钟
5. 加入xx 微升阴性液(Reagent C)
6. 上下倾倒数次,混匀(限定在3 秒之内)
7. 即刻放进分光光度仪检测,此为背景空对照:
(340 波长读数-380 波长读数)0 分钟-(340 波长读数-380 波长读数)1 分钟或3 分

三、样品总活性测定
1. 移取xx 微升缓冲液(Reagent A)到新的比色皿
2. 加入xx 微升反应液(Reagent B)
3. 加入xx 微升底物液(Reagent D)
4. 放进30℃培养箱里静置3 分钟
5. 加入100 微升待测样品(注意:10 微克总线粒体蛋白;样品须溶解;参见注意事项4)
6. 上下倾倒数次,混匀(限定在3 秒之内)
7. 即刻放进分光光度仪检测,此为样品总活性读数:
(340 波长读数-380 波长读数)0 分钟-(340 波长读数-380 波长读数)1 分钟或3 分

四、样品非特异活性测定
1. 移取xx 微升缓冲液(Reagent A)到新的比色皿
2. 加入xx 微升反应液(Reagent B)
3. 加入xx 微升专性液(Reagent E)
4. 加入xx 微升底物液(Reagent D)
5. 放进30℃培养箱里静置3 分钟
6. 加入100 微升待测样品(注意:10 微克总线粒体蛋白;样品须溶解;参见注意事项4)
7. 上下倾倒数次,混匀(限定在3 秒之内)
8. 即刻放进分光光度仪检测,此为样品非特异活性读数:
(340 波长读数-380 波长读数)0 分钟-(340 波长读数-380 波长读数)1 分钟或3 分

五、计算样品活性
1)样品活性(总活性或非特异活性)
2)样品特异活性
注意事项
1. 本产品为30 次(15 个样本)操作,包括背景对照测定
2. 操作时,须戴手套
3. 系统操作过程中,背景测定只需1 次
4. 线粒体样品检测前,须溶解;建议冻存融解(-70℃至37℃)循环3 次或使用线粒体
溶解试剂盒
5. 加入样品启动反应后3 秒内即刻比色测定
6. 通常反应1 分钟后比色测定值趋于稳定;测定值由高到低变化;测定可以持续3 分钟
7. 测定值由高到低变化,即3 分钟测定读数低于0 分钟测定读数,表明有酶活性
8. 比色测定后,比色皿须清洗彻底
9. 通常比色测定的OD340 起始读数0.5 为理想状态
10.如果用户没有双波长同步测定分光光度仪,可以使用单波长340nm 替代,注意活性计
算时,毫摩尔吸光系数变成6.2
11.建议待测样本线粒体蛋白浓度为10 微克/100 微升;如果样本酶活性过低或过高,则可
以增加或降低样本量;注意计算公式的调整
12.如果使用细胞或组织裂解悬液,则蛋白浓度为50 微克/100 微升
13.样品特异活性是指鱼藤酮敏感的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-辅酶Q 还原酶,去除
其它干扰因素(例如复合物II/III/IV 等)
14.线粒体呼吸链复合物I(NADH-辅酶Q 还原酶)单位活性定义为:在30℃,pH 7.5 条
件下,每分钟内能够氧化1 微摩尔还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)所需的酶量作
为一个活性单位
15.本公司提供系列线粒体及其酶类技术产品
质量标准
1. 本产品经鉴定性能稳定
2. 本产品经鉴定检测准确