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细胞脂质过氧化物(MDA)活性光度法定量检测试剂盒

 发布时间:2017-01-18 点击量:869

细胞脂质过氧化物(MDA)活性TBARS 光度法定量检测试剂盒

产品说明书

主要用途
细胞脂质过氧化物(MDA)活性TBARS 光度法定量检测试剂是一种旨在通过TBARS(硫代巴比妥酸反应
物)技术,与脂质过氧化性终端产物丙二醛反应,产生丙二醛双硫代巴比妥酸加合物,在分光光度仪下,
即采用光度法测定组织样品中总丙二醛含量,来评价细胞样品脂质过氧化程度的而经典的技术方法。
该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种动物细胞(人体、动物、昆虫等)中脂质过氧化程
度的检测。广泛用于细胞氧化应急研究,特别是脂质过氧化的分析。产品严格无菌,即到即用,操作简捷,
性能稳定,重复性好。
技术背景
脂质过氧化反应(lipid peroxidation;LPO)是动物和植物细胞损伤的一种机制,也是评价细胞和组织氧化
应急的标志。含有两个或以上双键(double bond)的多聚不饱和脂肪酸(Polyunsaturated Fatty Acid)对自
由基以及其它活性氧化族高度敏感,导致产生脂质过氧自由基LOO+(lipid peroxyl radical),使脂类氧化(lipid
oxidation)。脂质过氧化自由基LOO+同时通过攻击分子内双键,经环化、裂解形成环状内过氧化物(cyclic
endoperoxide),例如丙二醛(malondialdehyde;MDA)。作为脂质过氧化性低分子量终端产物之一的丙二
醛,广泛用于脂质过氧化反应的指标。在丁羟甲苯(Butylated Hydroxytoluene;BHT)和EDTA的参与帮助
减少干扰性脂类氧化的情况下,丙二醛与硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid;TBA)进行反应,产生丙二醛
双硫代巴比妥酸加合物(MDA-TBA2),通过分光光度仪(532nm波长)来定量分析丙二醛的含量,来评
价样品脂质过氧化程度。其反应方式为:
产品内容
缓冲液(Reagent A) 毫升
裂解液(Reagent B) 毫升
抗干扰液(Reagent C) 毫升
萃取液(Reagent D) 毫升
反应液(Reagent E) 管
补充液(Reagent F) 毫升
稀释液(Reagent G) 毫升
产品说明书1 份
保存方式
保存在4℃冰箱里,抗干扰液(Reagent C)和反应液(Reagent E)避免光照,并密封;萃取液(Reagent D)
具有腐蚀性,注意操作安全;有效保证6 月
用户自备
15 毫升锥形离心管:用于制备样品的容器
2
1.5 毫升离心管:用于样品操作的容器
细胞刮脱棒:用于脱落培养细胞
超声仪:用于裂解细胞的仪器
(微型)台式离心机:用于样品操作
恒温水槽:用于反应孵育
96 孔板:用于光度分析的容器
酶标仪:用于样品光度分析
实验步骤
实验开始前,将试剂盒中的反应液(Reagent E) 置入冰槽里。移取xx 微升稀释液(Reagent G)到反应
液(Reagent E)管里,涡旋混匀,标记为反应工作液(10 次操作量)。同时设定好酶标仪(温度为25℃):
波长532nm。然后进行下列操作。
一、样品准备
1. 准备好75cm2 细胞培养瓶或100mm 细胞培养皿的待测培养细胞(1 至5 X 107 细胞)
2. 小心加入xx 毫升缓冲液(Reagent A),覆盖生长表面
3. 小心抽去缓冲液
4. 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞
5. 加入xx 毫升缓冲液(Reagent A),混匀细胞
6. 移入到预冷的15 毫升锥形离心管(注意:悬浮细胞从这一步骤开始)
7. 放进4℃台式离心机离心5 分钟,速度为300g
8. 小心抽去上清液
9. 加入xx 微升裂解液(Reagent B),充分混匀
10.在冰槽里,置于200 瓦超声仪下,功率50%,猝击5 秒
11.转移到预冷的1.5 毫升离心管
12.强力涡旋震荡15 秒
13.放进4℃微型台式离心机离心10 分钟,速度为3000g(或6000RPM,例如eppendorf 5415)
14.小心移取500 微升上清液到新的预冷的1.5 毫升离心管
15.(选择步骤)移取10 微升进行蛋白定量测定,并调整蛋白浓度为20 至50 毫克/毫升
16.即刻放进-70℃保存或置于冰槽里继续后续操作
二、光度测定
1. 准备10 个1.5 毫升离心管,并做好相应标记:背景对照和样品
2. 分别移取xx 微升缓冲液(Reagent A)
3. 分别加入xx 微升抗干扰液(Reagent C)
4. 分别加入xx 微升补充液(Reagent F)或待测样品(注意:总量为1 至2 毫克总蛋白)
5. 用枪头混匀
6. 分别加入xx 微升萃取液(Reagent D)
7. 用枪头混匀
8. 分别加入xx 微升反应工作液
9. 盖上盖子,上下倾倒数次,混匀
3
10.放进60℃恒温水槽,孵育60 分钟
11.放进冰槽里冷却2 分钟
12.放进4℃微型台式离心机离心5 分钟,速度为10000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415)
13.分别移取250 微升上清液到96 孔板的相应孔里(注意:上清须澄清)
14.放进酶标仪检测
15.样品实际读数:(样品读数-背景对照读数)
三、计算样品总浓度
注意事项
1. 本产品为50 次(96 孔板)操作
2. 操作时,须戴手套
3. 用户可以采用组织匀浆(30 秒)处理代替超声处理
4. 萃取液(Reagent D)具有腐蚀性,注意操作安全
5. 反应液(Reagent E)为固体,避免在室温下放置;配制后,有效期1 周
6. 抗干扰液(Reagent C)和反应液(Reagent E)避免光照,并密封
7. 本产品检测敏感度可达0.05 微摩尔丙二醛
8. 50 微摩尔的过氧化氢会干扰检测(使丙二醛减少13%);而蔗糖和果糖则不影响检测
9. 如果样品含有过高的蛋白成分,建议进行样品去蛋白处理
10.可以使用煮沸10 分钟替代60℃孵育反应60 分钟
11.如果待测样品浓度过高或过低,可以调整样品浓度
12.用户可以检测脂质氧化抑制剂IC50
13.正常样品的丙二醛浓度相当低,约在皮摩尔水平,即10 至100 皮摩尔/毫克蛋白
14.本公司提供系列氧化检测试剂产品
质量标准
1. 本产品经鉴定性能稳定
2. 本产品经鉴定检测敏感