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细胞过氧化氢含量比色法定量检测试剂盒

 发布时间:2017-01-18 点击量:215

细胞过氧化氢(HYDROGEN PEROXIDE)含量比色法定量检测试剂盒
产品说明书
主要用途
细胞过氧化氢(HYDROGEN PEROXIDE)含量比色法定量检测试剂盒是一种旨在通过过氧化氢与二价铁
离子的氧化反应,进而与显色染料二甲酚橙结合,产生紫色复合产物所呈现的吸光峰值的变化,即采用比
色法来测定细胞裂解样品中过氧化氢含量的而经典的技术方法。该技术经过精心改良芬顿(Fenton)
反应、成功实验证明的。其适用于各种细胞裂解悬液样品(动物、人体等)过氧化氢的浓度检测,以及抑
制剂筛选。产品严格无菌,即到即用,操作简捷,性能稳定。
技术背景
过氧化氢(hydrogen peroxide;H2O2)是一种普遍存在的反应性毒性代谢副产物,通过线粒体呼吸链系统
或氧化酶系统产生,受到过氧化酶(peroxidase)和过氧化氢酶(catalase)还原为水而去除。由于过氧化氢
成为许多氧化应激状态相关的关键调节因子,诸如NF-ΚB信号通路、氢过氧化介导通路等,因此过氧化氢
的产生与哮喘、动脉硬化、糖尿病血管病、骨质疏松症、神经性退行性病变和唐氏综合症等疾病关联。过
氧化氢的含量检测,可以反映机体内的过氧化情况,同时反映机体内细胞活性、蛋白质糖基化、脂质氧化
等。基于底物过氧化氢,在酸性条件下,与二价铁(ferric)离子反应(Fenton 反应),氧化产生三价铁离
子(ferrous)和羟自由基,进而三价铁离子与染料二甲酚橙(3,3'-Bis(N,N-di-(carboxymethyl)aminomethyl)-
o-cresolsulfone-phthalein;xylenol orange)结合,形成稳定的紫色复合物,通过其吸收峰值的变化
(560nm波长),来定量分析过氧化氢的含量。其反应系统为:
产品内容
清理液(Reagent A) 毫升
裂解液(Reagent B) 毫升
反应液(Reagent C) 微升
显色液(Reagent D) 毫升
阴性液(Reagent E) 微升
产品说明书1 份
保存方式
保存在4℃冰箱里;反应液(Reagent C)和阴性液(Reagent E)具有腐蚀性,注意操作安全;显色液(Reagent
D)避免光照;有效保证6 月
用户自备
15 毫升锥形离心管:用于样品操作的容器
1.5 毫升离心管:用于样品操作和保存的容器
2
细胞刮脱棒:用于细胞脱离
4℃(微型)台式离心机:用于样品处理
比色皿或酶标板:用于比色的容器
分光光度仪或酶标仪:用于比色分析
实验步骤
一、样品准备
1. 准备好25cm2 细胞培养瓶或60mm 细胞培养皿的待测培养细胞(1 至5 X 106 细胞)
2. 小心加入xx 毫升清理液(Reagent A),覆盖生长表面
3. 小心抽去清理液
4. 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞(注意:可以使用胰酶消化)
5. 加入xx 毫升清理液(Reagent A),混匀细胞
6. 移入到预冷的15 毫升锥形离心管(注意:悬浮细胞从这一步骤开始)
7. 放进4℃台式离心机离心5 分钟,速度为300g
8. 小心抽去上清液
9. 加入xx 微升裂解液(Reagent B),充分混匀
10.转移到预冷的1.5 毫升离心管
11.强力涡旋震荡15 秒
12.置于冰槽里孵育30 分钟
13.放进4℃微型台式离心机离心5 分钟,速度为16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415)
14.小心移取500 微升上清液到新的预冷的1.5 毫升离心管
15.移取10 微升进行蛋白定量检测
16.即刻放进-70℃保存或置于冰槽里继续后续操作
二、测定准备
1. 开启并设定好分光光度仪(温度为25℃):波长560nm,并置零
2. 从4℃冰箱里取出试剂,室温下均衡;显色液(Reagent D)避免光照
三、背景对照测定
1. 移取xx 微升显色液(Reagent D)到新的比色皿
2. 加入xx 微升阴性液(Reagent E)
3. 加入100 微升待测样品
4. 上下倾倒数次,混匀
5. 在25℃温度下孵育30 分钟
6. 即刻放进分光光度仪检测,此为样本背景对照
四、样品测定
1. 移取xx 微升显色液(Reagent D)到新的比色皿
2. 加入xx 微升反应液(Reagent C)
3. 加入100 微升待测样品
3
4. 上下倾倒数次,混匀
5. 在25℃温度下孵育30 分钟
6. 即刻放进分光光度仪检测,此为样本读数
五、计算样品浓度
六、酶标板测定
1. 在96 孔酶标板上做好相应标记:背景对照和样品
2. 分别移取xx 微升显色液(Reagent D)到96 孔板中的所有孔里
3. 加入xx 微升阴性液(Reagent E)到背景对照孔
4. 加入xx 微升反应液(Reagent C)到样品孔
5. 分别加入25 微升待测样品到所有孔中(注意:样品须清澈)
6. 轻轻摇动96 孔酶标板
7. 在25℃温度下孵育30 分钟
8. 即刻放进酶标仪检测:获得吸光读数
9. 浓度计算:
注意事项
1. 本产品为20 次(比色皿)或80 次(酶标板)操作,包括背景对照
2. 本产品检测范围是1.5 至100 微摩尔/升
3. 操作时,须戴手套
4. 反应液(Reagent C)和阴性液(Reagent E)具有腐蚀性,注意操作安全
5. 避免使用EDTA、乙醇、DMSO、BHT、MES、HEPES 等处理样品,否则干扰检测
6. 样品中含有大于100 毫摩尔的葡萄糖、蔗糖、果糖、山梨醇、甲酸等,影响检测
7. 样品须澄清,至关重要
8. 如果用户没有匹配的滤波器,可以使用540 至620nm 波长的任一波长替代
9. 测定值由低到高变化
10.比色测定后,比色皿须清洗彻底
11.建议未知浓度范围的待测样本稀释100 倍进行检测;待测样品过氧化氢浓度大于1 毫摩尔,必须进行
稀释,否则检测不准
12.如果待测样品浓度过高或过低,可以调整样品浓度
13.本公司提供系列过氧化氢检测试剂产品
质量标准
1. 本产品经鉴定性能稳定
2. 本产品经鉴定检测敏感