欢迎进入上海语燕生物技术有限公司!
技术文章
首页 > 技术文章 > 组织蛋白激酶A(PKA)活性光谱法定量检测试剂盒

组织蛋白激酶A(PKA)活性光谱法定量检测试剂盒

 发布时间:2017-01-18 点击量:181

组织蛋白激酶A(PKA)活性光谱法定量检测试剂盒

产品说明书
主要用途
组织蛋白激酶A(PKA)活性光谱法定量检测试剂是一种旨在通过多肽底物受到PKA磷酸化后,进而由丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶连续循环法反应系统,测定产生ADP过程中,伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的氧化反应, 即采用光谱法测定其氧化后峰值的变化,以分析组织裂解样品中PKA活性的而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。其适用于各种组织裂解萃取液样品(动物、人体)、部分或完全纯化酶样品中PKA激酶的定量检测,以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌,即到即用,操作简捷,性能稳定,高度敏感。
技术背景
蛋白激酶A(protein kinase A;PKA),又称cAMP依赖性蛋白激酶(cAMP dependent protein kinase),是第二信使依赖性酶。通过影响腺苷酸环化酶(adenylate cyclase;AC)和磷酸二酯酶(phosphodiesterase)的活性,而决定cAMP水平,达到调节PKA活性,进而调节细胞对于各种外部刺激的反应,包括细胞生长、代谢、DNA复制、细胞分裂、肌动蛋白细胞骨架重排等。该全酶(holoenzyme)具有两个催化亚体和两个调节亚体构成的四联体结构。cAMP结合调节亚体,而释放出活化的催化亚体,产生目标蛋白上丝/苏氨酸(serine/threonine)的磷酸化,诸如CREB、Histone H1、CREM、NF-κB和核受体等,而调控一系列细胞活动。其磷酸化目标序列为Arg-Arg-X-Ser/Thr或Lys-Arg-X-X- Ser/Thr。蛋白激酶A 至少有两个亚酶:I型亚酶存在于胞浆内,而二型亚酶与细胞膜、细胞器和细胞骨架相关。基于底物LRRASLG,在ATP的存在下,受到PKA激酶的磷酸化,获得产物磷酸化多肽,进而通过丙酮酸激酶(pyruvate kinase;PK)和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase;LDH)反应系统中,还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide;NADH)转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide;NAD),其吸光峰值的变化(340nm),来定量分析蛋白激酶A的活性。其反应方式为:
产品内容
清理液(Reagent A) 毫升
裂解液(Reagent B) 毫升
缓冲液(Reagent C) 毫升
酶促液(Reagent D) 微升
反应液(Reagent E) 微升
底物液(Reagent F) 微升
阴性液(Reagent G) 微升
产品说明书 1份
保存方式
保存清理液(Reagent A)在4℃冰箱里;其余的保存在-20℃冰箱里,严格避免光照和反复冻融;有效保证6月
1
用户自备
PKA激酶:用于抑制剂筛选
1.5毫升离心管:用于样品保存的容器
15毫升锥形离心管:用于样品处理的容器
(微型)台式离心机:用于样品预处理
比色皿或酶标板:用于光谱分析操作的容器
分光光度仪或酶标仪:用于样品光谱分析
实验步骤
一、 待测样品准备
1. 手术取出动物组织,并秤重500毫克组织重量
2. (选择步骤)放进预冷的15毫升锥形离心管
3. (选择步骤)加入xx毫升清理液(Reagent A)清洗
4. (选择步骤)抽去清理液
5. 移入到一个液氮冻存管
6. 即刻放进液氮罐过一夜
7. 次日从液氮罐里取出,即刻(快速度)用研磨棒碾碎组织成粉末状(注意:切莫使组织冻融)
8. 放进一个15毫升锥形离心管
9. 加入置于冰槽里的xx微升裂解液(Reagent B)
10.强力涡旋震荡30秒,充分混匀
11.放进冰槽里孵育30分钟,期间每10分钟强力涡旋震荡30秒(注意:如需暂时停止,放进-70℃冰箱里储存备用)
12.即刻放进4℃台式离心机离心10分钟,速度为10000g
13.小心移取上清液到新的无菌的1.5毫升离心管
14.移取xx微升进行蛋白定量检测(注意:建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒-)
15.放进-70℃的冰箱里保存或置于冰槽里备用
二、 测定准备
1. 准备好待测样品(例如组织裂解悬液等),置于冰槽里
2. 设定好分光光度仪(温度为30℃):波长为340nm,间隔1分钟,读数6次(共5分钟),并置零
三、 背景对照测定
1. 移取xx微升缓冲液(Reagent C)到新的比色皿
2. 加入xx微升酶促液(Reagent D)
3. 加入xx微升反应液(Reagent E)
4. 加入xx微升底物液(Reagent F)
5. 放进30℃培养箱里静置3分钟
6. 加入xx微升阴性液(Reagent G)
7. 上下倾倒数次,混匀(限定在3秒之内) 2
8. 即刻放进分光光度仪检测,此为背景空对照:340波长读数0分钟 -340波长读数5分钟
四、 样品测定
1. 移取xx微升缓冲液(Reagent C)到新的比色皿
2. 加入xx微升酶促液(Reagent D)
3. 加入xx微升反应液(Reagent E)
4. 加入xx微升底物液(Reagent F)
5. 放进30℃培养箱里静置3分钟
6. 加入5微升待测样品(注意:50微克细胞裂解蛋白;样品须溶解)
7. 上下倾倒数次,混匀(限定在3秒之内)
8. 即刻放进分光光度仪检测,此为样品总活性读数:340波长读数0分钟 -340波长读数5分钟
五、 计算样品活性
[(样品读数-背景读数)X 0.1(毫升,体系容量)X样品稀释倍数]÷[xx(样品容量,毫升)X xx(毫摩尔吸光系数)X 5(反应时间,分钟)]=单位/毫升÷(样品蛋白浓度)毫克/毫升=单位/毫克
单位=微摩尔NADH/分钟
六、 酶标板测定
1. 在96孔酶标板上做好相应标记:背景对照和样品
2. 分别移取xx微升缓冲液(Reagent C)到96孔板中
3. 分别加入xx微升酶促液(Reagent D)
4. 分别加入xx微升反应液(Reagent E)
5. 分别加入xx微升底物液(Reagent F)
6. 轻轻摇动96孔酶标板
7. 在30℃温度下孵育3分钟
8. 分别加入xx微升阴性液(Reagent G)或待测样品(50微克细胞裂解悬液蛋白)到相应孔中(注意:样品须清澈)
9. 轻轻摇动酶标板
10.即刻放进酶标仪检测:0分钟读数和5分钟读数
11.活性计算:
[(样品读数-背景读数)X样品稀释倍数Xxx(毫升,体系容量)]÷[xx(样品容量,毫升)X xx(毫摩尔吸光系数)X 0.6(厘米)X 5(分钟)]=单位/毫升÷(样品蛋白浓度)毫克/毫升=单位/毫克
单位=微摩尔NADH/分钟
七、抑制剂筛选
1. 在96孔酶标板上做好相应标记:背景、完全活性和待测抑制剂样品
2. 按下表加入试剂,进行样品预处理 3
内容物
空背景对照
样本背景
完全酶活性
待测抑制剂酶活性
缓冲液(Reagent C)
微升
微升
微升
微升
阴性液(Reagent G)
微升
微升
微升
——
待测抑制剂
——
5微升
――
5微升
用户自备的纯化酶
——
——
5微升(1毫单位)
5微升(1毫单位)
96孔板每孔总量
空背景对照孔
( 微升)
样本背景孔
( 微升)
完全活性孔
( 微升)
待测抑制剂样品孔
( 微升)
轻轻摇动酶标板,混匀,放进30℃培养箱里孵育30分钟。然后进行下列操作
3. 分别移取xx微升缓冲液(Reagent C)到新的96孔板的所有孔里
4. 分别加入xx微升酶促液(Reagent D)
5. 分别加入xx微升反应液(Reagent E)
6. 分别加入xx微升底物液(Reagent F)
7. 轻轻摇动酶标板
8. 在30℃温度下孵育3分钟
9. 加入20微升上述预处理的待测样品
10.即刻放进30℃酶标仪检测:测读30分钟
11.抑制活性计算:
1) [(完全活性读数-空背景对照读数)-(抑制剂样品活性读数-样本背景读数)]÷(完全活性读数-空背景对照读数)=实际抑制百分率
2) IC50:50%抑制率所需的抑制剂浓度
X(所需抑制剂样品浓度)=(已知抑制剂样品浓度÷实际抑制百分率)X 50%
3) 直接构建抑制曲线:纵座标(Y轴)为吸光单位(OD);横座标(X轴)为已知抑制剂浓度
注意事项
1. 本产品为25次操作,包括背景操作
2. 操作时,须戴手套
3. 系统操作过程中,背景测定只需1次
4. 样品处理忌用磷酸缓冲溶液
5. 样品须澄清,至关重要
6. 加入样品启动反应后3秒内即刻光谱测定
7. 测定值由高到低变化;测定可持续30分钟
8. 光谱测定后,比色皿须清洗彻底
9. 样本测定0分钟读数高于5分钟读数表明具有酶活性
10.建议待测样本蛋白浓度为50微克/5微升(本公司提供 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒-)
11.如果待测样品浓度过高或过低,可以调整样品浓度
12.可以使用蛋白激酶A抑制剂(PKA-PKI)作为抑制剂对照或阴性对照
13.蛋白激酶A活性单位浓度定义:在30℃温度下,pH 7.5条件下,每分钟内能够氧化1微摩尔还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)所需的酶量作为一个活性单位 4
14.本公司提供系列蛋白激酶检测试剂产品
质量标准
1. 本产品经鉴定性能稳定
2. 本产品经鉴定检测敏感