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组织糖原磷酸化酶总活性酶连续循环比色法定量检测试剂盒

 发布时间:2017-01-18 点击量:133

组织糖原磷酸化酶总活性酶连续循环比色法定量检测试剂盒

产品说明书

 

主要用途

 

组织糖原磷酸化酶总活性酶连续循环比色法定量检测试剂是一种旨在通过磷酸葡萄糖变位酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶连续反应系统中氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)还原后峰值的增高,即采用比色法来测定组织裂解萃取样品中酶活性的而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。其适用于各种组织裂解萃取悬液样品(动物、人体、植物、昆虫等)糖原磷酸化酶包括a和b的总活性检测。产品严格无菌,即到即用,操作简捷,性能稳定。

 

技术背景

 

糖原磷酸化酶(glycogen phosphorylase;EC2.4.1.1)是磷酸化酶家属之一,在机体糖原分解(glycogenolysis)利用上发挥重要作用。其结构为同源双体,有两种组合形式:紧密型(tense)和松弛型(relaxed)。处于紧密型的酶与糖原结合,增强活性。未经修饰的酶(糖原磷酸化酶b)催化产生足够的葡萄糖-1-磷酸,进入糖酵解循环,生成ATP。糖原磷酸化酶催化糖原上α(1→4)糖苷链(glycosidic linkage)的磷酸分解(phosphorolytic cleavage)反应,释放葡萄糖-1-磷酸产物。糖原磷酸化酶在肝组织、肌肉组织和脑组织中有不同类型的异构体。糖原磷酸化酶分为a型和b型:a型为活化状态,而b型为非活化状态,在单磷酸腺苷(AMP)的激活下,转化为a型。糖原磷酸化酶的缺失将导致肌肉McArdle综合征和肝Hers病。基于底物糖原(glycogen)在糖原磷酸化酶的催化下,分解并产生葡萄糖-1-磷酸(α-D-Glucose-1-Phosphate)产物后,通过磷酸葡萄糖变位酶(phosphoglucomutase;PGLUM)和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase;G-6-PDH)反应系统,测定氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)(oxidized nicotinamide adenine dinucleotide phosphate;NADP)转化为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate;NADPH)所产生的吸光峰值的变化(340nm 波长),来定量分析糖原磷酸化酶的总活性。糖原磷酸化酶酶连续循环反应系统为:

 

产品内容

清理液(Reagent A)

毫升

裂解液(Reagent B)

毫升

缓冲液(Reagent C

毫升

底色液(Reagent D)

毫升

反应液(Reagent E)

毫升

阴性液(Reagent F)

微升

明书

1份

 

保存方式

 

保存缓冲液(Reagent C)、底色液(Reagent D)和反应液(Reagent E)在-20℃冰箱里; 其余的保存在4℃冰箱里,底色液(Reagent D)和反应液(Reagent E)避免光照;有效保证6月

 

用户自备

 

1.5毫升离心管:用于样品制备和保存的容器

15毫升锥形离心管:用于样品制备的容器

(微型)台式离心机:用于样品制备

比色皿或酶标板:用于比色的容器

分光光度仪或酶标仪:用于比色分析

 

实验步骤

 

实验开始前,将-20℃冰箱里的试剂盒中的裂解液(Reagent B)置入冰槽里融化。然后进行下列操作。

 

一、 样品准备

 

1. 手术取出动物组织,并秤重以确定组织重量

2. (选择步骤)放进预冷的15毫升锥形离心管

3. (选择步骤)加入适量的(500毫克组织需要xx毫升)清理液(Reagent A)清洗1次

4. 移入到一个液氮冻存管

5. 即刻放进液氮罐过一夜

6. 次日从液氮罐里取出,即刻(快速度)用研磨棒碾碎组织成粉末状(注意:切莫使组织冻融)

7. 放进一个15毫升锥形离心管

8. 加入置于冰槽里的xx微升裂解液(Reagent B)

9. 转移到1.5毫升离心管

10.强力涡旋震荡30秒,充分混匀

11.放进冰槽里孵育30分钟,期间每10分钟强力涡旋震荡30秒(注意:如需暂时停止,放进-70℃冰箱里储存备用)

12.即刻放进4℃微型台式离心机离心10分钟,速度为16000g (或13000RPM。例如EPPENDORF 5415)

13.小心移取上清液到新的1.5毫升离心管

14.移取10微升进行蛋白定量检测

15.放进-70℃的冰箱里保存或置于冰槽里备用

 

二、 测定准备

 

1. 开启并设定好分光光度仪(温度为30℃):波长340nm,间隔60秒,读数6次(共5分钟),并置零

2. 从-20℃冰箱里取出试剂,置于冰槽里融化;底色液(Reagent D)避免光照

 

三、 背景对照测定

 

1. 移取xx微升缓冲液(Reagent C)到新的比色皿

2. 加入xx微升底色液(Reagent D)

3. 加入xx微升反应液(Reagent E)

4. 上下倾倒数次,混匀

5. 在30℃温度下孵育2分钟

6. (选择步骤)放进分光光度仪,置零

7. (选择步骤)取出比色皿

8. 加入20微升阴性液(Reagent F)

9. 上下倾倒数次,混匀(限定在3秒之内)

10.即刻放进分光光度仪检测,此为背景空对照(5分钟读数-0分钟读数)

 

四、 样品测定

 

1.移取xx微升缓冲液(Reagent C)到新的比色皿

2.加入xx微升底色液(Reagent D)

3.加入xx微升反应液(Reagent E)

4.上下倾倒数次,混匀

5.在30℃温度下孵育2分钟

6.(选择步骤)放进分光光度仪,置零

7.(选择步骤)取出比色皿

8.加入20微升待测样品(20微克蛋白)(注意:样品须清澈,且pH为6.8)

9.上下倾倒数次,混匀(限定在3秒之内)

10.即刻放进分光光度仪检测,此为样品读数(5分钟读数-0分钟读数)

 

五、 计算样品活性

 

[(样品读数-背景读数)X xx(体系容量,毫升)X样品稀释倍数]÷[xx(样品容量,毫升)Xxx(毫摩尔吸光系数)X 5(分钟)]=单位/毫升÷(样品蛋白浓度)毫克/毫升=单位/毫克

单位=微摩尔NADP/分钟

 

六、 酶标板测定

 

1. 在96孔酶标板上做好相应标记:背景对照和样品

2. 分别移取xx微升缓冲液(Reagent C)到所有孔中

3. 分别加入xx微升底色液(Reagent D)到所有孔中

4. 分别加xx微升反应液(Reagent E)到所有孔中

5. 轻轻摇动96孔酶标板

6. 在30℃温度下孵育2分钟

7. 分别加xx微升阴性液(Reagent F)或待测样品(10微克蛋白)(注意:样品须清澈,且pH为6.8)到相应孔里

8. 轻轻摇动酶标板

9. 即刻放进酶标仪检测,包括0分钟读数和5分钟读数)

10.活性计算

[(样品读数-背景读数)X样品稀释倍数X xx(毫升,体系容量)]÷[xx(样品容量,毫升)Xxx(毫摩尔吸光系数)Xxx(厘米)X xx(分钟)]=单位/毫升÷(样品蛋白浓度)毫克/毫升=单位/毫克

单位=微摩尔NADP/分钟

 

注意事项

 

1. 本产品为10次(比色皿)和40次(酶标板)操作,包括背景对照

2. 操作时,须戴手套

3. 系统操作过程中,背景测定只需1次

4. 建议使用比色皿测定

5. 样品须澄清,至关重要

6. 加样后3秒内比色测定

7. 测定值由低到高变化;测定可持续5分钟

8. 比色测定后,比色皿须清洗彻底

9. 样本测定5分钟读数高于0分钟读数表明具有酶活性

10.建议待测样本蛋白浓度为20微克/20微升;如果样本酶活性过低或过高, 则可以增加或降低样本量

11.如果待测样品浓度过高或过低,可以调整样品浓度

12.糖原磷酸化酶单位活性定义为:在30℃,pH 6.8条件下,每分钟内能够转化1微摩尔糖原和正磷酸(orthophosphate)至葡萄糖-1-磷酸所需的酶量作为一个活性单位

13.本公司提供系列细胞磷酸化酶学检测试剂产品

 

质量标准

 

1. 本产品经鉴定性能稳定

2. 本产品经鉴定检测敏感