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细胞丙酮酸激酶总活性比色法定量检测试剂盒

 发布时间:2017-01-18 点击量:470

细胞丙酮酸激酶总活性比色法定量检测试剂盒

产品说明书
主要用途
细胞丙酮酸激酶总活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶的酶偶联反应系统中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)氧化后峰值的降低,即采用比色法来测定细胞裂解萃取样品中酶活性的而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞裂解萃取悬液样品(动物、人体、植物、昆虫等)丙酮酸激酶的总活性检测。产品严格无菌,即到即用,操作简捷,性能稳定。
技术背景
丙酮酸激酶(Pyruvate Kinase;PK)是细胞代谢的调节酶,催化细胞糖酵解的后反应:将磷酸烯醇丙酮酸(phosphoenol pyruvate;PEP)转化成丙酮酸(pyruvate),同时产生ATP。丙酮酸激酶由4个相同的亚单位构成,在肝组织、肌肉组织和红细胞中有不同类型的异构体。果糖-2,6-二磷酸(Fructose-2,6-bisphosphate;F2,6BP)是该酶的激活剂,而ATP、蛋氨酸(alanine)、乙酰辅酶A (Acetyl-CoA)是该酶的抑制剂。丙酮酸激酶的活性检测用来评价细胞或组织,包括红细胞的损害状况。基于磷酸烯醇丙酮酸转化成丙酮酸后,通过乳酸脱氢酶系统,测定还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide;NADH)转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide;NAD)的峰值变化(340nm 波长),来定量分析丙酮酸激酶的活性。丙酮酸激酶反应系统为:
产品内容
清理液(Reagent A) 毫升
裂解液(Reagent B) 毫升
缓冲液(Reagent C) 毫升
反应液(Reagent D) 毫升
底物液(Reagent E) 毫升
阴性液(Reagent F) 微升
产品说明书 1份
保存方式
保存反应液(Reagent D)和底物液(Reagent E)在-20℃冰箱里,避免光照;其余的保存在4℃冰箱里,有效保证6月
用户自备
1.5毫升离心管:用于样品制备和保存的容器
15毫升锥形离心管:用于样品制备的容器
细胞刮脱棒:用于细胞脱离
(微型)台式离心机:用于样品操作
比色皿或酶标板:用于比色的容器 1
Bradford
分光光度仪或酶标仪:用于比色分析
实验步骤
实验开始前,将-20℃冰箱里的试剂盒中的反应液(Reagent D)和底物液(Reagent E)置入冰槽里融化。然后进行下列操作。
一、 样品准备
1. 准备好25cm2细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞(1至5 X 106细胞)
2. 小心加入xx毫升清理液(Reagent A),覆盖生长表面
3. 小心抽去清理液
4. 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞(注意:可以使用胰酶消化)
5. 加入xx毫升清理液(Reagent A),混匀细胞
6. 移入到预冷的15毫升锥形离心管(注意:悬浮细胞从这一步骤开始)
7. 放进4℃台式离心机离心5分钟,速度为300g
8. 小心抽去上清液
9. 加入xx微升裂解液(Reagent B),充分混匀
10.转移到预冷的1.5毫升离心管
11.强力涡旋震荡15秒
12.置于冰槽里孵育30分钟
13.放进4℃微型台式离心机离心5分钟,速度为16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415)
14.小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
15.移取10微升进行蛋白定量检测(注意:建议使用蛋白质浓度定量试剂盒-)
16.即刻放进-70℃保存或置于冰槽里继续后续操作
二、 测定准备
1. 准备好待测样品(例如细胞裂解萃取悬液样品等),置于冰槽里
2. 设定好分光光度仪(温度为30℃):波长340nm,间隔60秒,读数6次(共5分钟),并置零
三、 背景对照测定
1. 移取xx微升缓冲液(Reagent C)到新的比色皿
2. 加入xx微升反应液(Reagent D)
3. 加入xx微升底物液(Reagent E)
4. 上下倾倒数次,混匀
5. 在30℃温度下孵育3分钟
6. 加入xx微升阴性液(Reagent F)
7. 上下倾倒数次,混匀(限定在3秒之内)
8. 即刻放进分光光度仪检测,此为背景空对照(0分钟读数-5分钟读数),正常读数差值为0.001至0.005
四、 样品测定 2
1. 移取xx微升缓冲液(Reagent C)到新的比色皿
2. 加入xx微升反应液(Reagent D)
3. 加入xx微升底物液(Reagent E)
4. 上下倾倒数次,混匀
5. 在30℃温度下孵育3分钟
6. 加入20微升待测样品(50微克细胞裂解总蛋白)(注意:样品须清澈,且pH为7.5)
7. 上下倾倒数次,混匀(限定在3秒之内)
8. 即刻放进分光光度仪检测,此为样品读数(0分钟读数-5分钟读数),通常活性读数差值为正数
五、计算样品活性
[(样品读数-背景读数)X 1(体系容量;毫升)X样品稀释倍数]÷[0.02(样品容量;毫升)X 6.22(毫摩尔吸光系数)X 5(分钟)]=单位/毫升÷(样品蛋白浓度)毫克/毫升=单位/毫克
单位=微摩尔PEP/分钟
六、 酶标板测定
1. 在96孔酶标板上做好相应标记:背景对照和样品
2. 分别移取xx微升缓冲液(Reagent C)到相应孔中
3. 分别加入xx微升反应液(Reagent D)
4. 分别加入xx微升底物液(Reagent E)
5. 轻轻摇动96孔酶标板
6. 在30℃温度下孵育3分钟
7. 分别加入xx微升阴性液(Reagent F)或待测样品(50微克细胞裂解总蛋白)(注意:样品须清澈,且pH为7.5)
8. 轻轻摇动酶标板
9. 即刻放进酶标仪检测,包括(0分钟初始读数和5分钟读数)
10.活性计算
[(样品读数-背景读数)X样品稀释倍数Xxx(体系容量;毫升)]÷[xx(样品容量;毫升)X 6.22(毫摩尔吸光系数)X 0.6(厘米)X 5(分钟)]=单位/毫升÷(样品蛋白浓度)毫克/毫升=单位/毫克
单位=微摩尔PEP/分钟
注意事项
1. 本产品为20次(比色皿)和80次(酶标板)操作,包括背景对照
2. 操作时,须戴手套
3. 系统操作过程中,背景测定只需1次
4. 样品须澄清,至关重要
5. 建议使用比色皿测定 3
6. 加样后3秒内比色测定
7. 测定值由高到低变化;测定可持续5分钟
8. 比色测定后,比色皿须清洗彻底
9. 背景空对照0分钟读数通常0.2至0.8为理想状态
10.背景空对照的正常读数差值(0分钟-5分钟)通常为0.001至0.005(正负即可)
11.样品0分钟读数通常和背景空对照0分钟读数一致
12.样本测定5分钟读数低于0分钟读数表明具有酶活性
13.建议待测样本蛋白浓度为50微克/20微升;如果样本酶活性过低或过高,则可以增加或降低样本量(本公司提供 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒)
14.如果待测样品浓度过高或过低,可以调整样品浓度
15.丙酮酸激酶单位活性定义为:在30℃,pH 7.2条件下,每分钟内能够转化1微摩尔磷酸烯醇丙酮酸至丙酮酸所需的酶量作为一个活性单位
16.本公司提供系列细胞酶学检测试剂产品
质量标准
1. 本产品经鉴定性能稳定
2. 本产品经鉴定检测敏感
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