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细胞磷酸果糖激酶活性酶连续循环光谱法定量检测试剂盒

 发布时间:2017-01-18 点击量:568

YY50111.1 v.A
细胞磷酸果糖激酶活性酶连续循环光谱法定量检测试剂盒

产品说明书

主要用途
细胞磷酸果糖激酶(PHOSPHOFRUCTOKINASE)活性酶连续循环光谱法定量检测试剂是一种旨在通过醛缩酶、磷酸丙糖异构酶和α-甘油磷酸脱氢酶的酶连续反应系统中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)氧化后吸光峰值的降低,即采用光谱法来测定细胞裂解样品中酶活性的而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞裂解悬液样品(动物、人体、植物、昆虫、细菌等)磷酸果糖激酶的总活性检测。产品严格无菌,即到即用,操作简捷,性能稳定。
技术背景
磷酸果糖激酶(6-phosphofructokinase;PFK;EC2.7.1.11)存在于所有生命体的细胞里,包括真核生物、古生菌(Archaea)和原核生物,尤其存在在肌肉组织、脑组织和植物组织中。磷酸果糖激酶是糖酵解通路的关键调节酶,可被高浓度的ATP和柠檬酸阻抑,ADP和AMP活比。其分子量达360kd,结构为同源四体,受到化学物的作用发生变构效应(allosteric effect)调节酶的活性。磷酸果糖激酶以ATP作为磷酸基团供体(phosphoryl donor)催化果糖-6-磷酸(fructose 6-phosphate;F-6-P)的磷酸化为果糖-1,6-二磷酸(fructose 1,6-bisphosphate;F-6-P2)。磷酸果糖激酶缺陷将导致麦卡德尔肌病(McArdle's disease),机体则无法利用肌肉内糖原作为能量来源。基于果糖-6-磷酸在磷酸果糖激酶的作用下,转化为葡萄糖-1-磷酸产物后,通过醛缩酶(aldolase)、磷酸丙糖异构酶(triosephosphate isomerase)和α-甘油磷酸脱氢酶(α-glycerol phosphate dehydrogenase)系统,测定还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide;NADH)转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(oxidized nicotinamide adenine dinucleotide;NAD),产生的吸光峰值的变化(340nm 波长),来定量分析磷酸果糖激酶的总活性。磷酸果糖激酶连续循环反应系统为:
6-phosphofructokinase
fructose-6-phosphate + ATP → fructose-1,6-bisphosphate + ADP
aldolase
fructose-1,6-bisphosphate → glyceraldehyde-3-phosphate + dihydroxyacetone phosphate
triosephosphate isomerase
glyceraldehyde-3-phosphate → dihydroxyacetone phosphate
α-glycerol phosphate dehydrogenase
2 dihydroxyacetone phosphate + 2 NADH → 2 glycerol-3-phosphate + 2 NAD+
(高吸收峰) (低吸收峰)
产品内容
清理液(Reagent A) 120毫升 1
裂解液(Reagent B) 10毫升
缓冲液(Reagent C) 20毫升
底色液(Reagent D) 2毫升
反应液(Reagent E) 2毫升
阴性液(Reagent F) 1毫升
产品说明书 1份
保存方式
保存裂解液(Reagent B)、缓冲液(Reagent C)、底色液(Reagent D)和反应液(Reagent E)在-20℃冰箱里;其余的保存在4℃冰箱里;底色液(Reagent D)和反应液(Reagent E)避免光照;有效保证6月
用户自备
1.5毫升离心管:用于样品制备和保存的容器
15毫升锥形离心管:用于样品制备的容器
细胞刮脱棒:用于细胞脱离
(微型)台式离心机:用于样品操作
比色皿或酶标板:用于光谱分析的容器
分光光度仪或酶标仪:用于光谱分析
实验步骤
实验开始前,将-20℃冰箱里的试剂盒中的裂解液(Reagent B)置入冰槽里融化。然后进行下列操作。
一、 样品准备
1. 准备好25cm2细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞(1至5 X 106细胞)
2. 小心加入3毫升清理液(Reagent A),覆盖生长表面
3. 小心抽去清理液
4. 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞(注意:可以使用胰酶消化)
5. 加入3毫升清理液(Reagent A),混匀细胞
6. 移入到预冷的15毫升锥形离心管(注意:悬浮细胞从这一步骤开始)
7. 放进4℃台式离心机离心5分钟,速度为300g
8. 小心抽去上清液
9. 加入500微升裂解液(Reagent B),充分混匀
10.转移到预冷的1.5毫升离心管
11.强力涡旋震荡15秒
12.置于冰槽里孵育30分钟
13.放进4℃微型台式离心机离心5分钟,速度为16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415)
14.小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
15.移取10微升进行蛋白定量检测(注意:建议使用YY Bradford蛋白质浓度定量试剂盒-
2
YY30030.1)
16.即刻放进-70℃保存或置于冰槽里继续后续操作
二、 测定准备
1. 开启并设定好分光光度仪(温度为25℃):波长340nm,间隔60秒,读数6次(共5分钟),并置零
2. 从-20℃冰箱里取出试剂,置于冰槽里融化;底色液(Reagent D)避免光照
三、 背景对照测定
1. 移取780微升缓冲液(Reagent C)到新的比色皿
2. 加入100微升底色液(Reagent D)
3. 加入100微升反应液(Reagent E)
4. 上下倾倒数次,混匀
5. 在25℃温度下孵育3分钟
6. 加入20微升阴性液(Reagent F)
7. 上下倾倒数次,混匀(限定在3秒之内)
8. 即刻放进分光光度仪检测,此为背景空对照(0分钟读数-5分钟读数)
四、 样品测定
1. 移取780微升缓冲液(Reagent C)到新的比色皿
2. 加入100微升底色液(Reagent D)
3. 加入100微升反应液(Reagent E)
4. 上下倾倒数次,混匀
5. 在25℃温度下孵育3分钟
6. 加入20微升待测样品(20微克蛋白)(注意:样品须清澈)
7. 上下倾倒数次,混匀(限定在3秒之内)
8. 即刻放进分光光度仪检测,此为样品读数(0分钟读数-5分钟读数)
五、计算样品活性
[(样品读数-背景读数)X 1(毫升,测定体系)X样品稀释倍数]÷[0.02(样品容量,毫升)X 6.22(毫摩尔吸光系数)X 5(分钟)X 2]=单位/毫升÷(样品蛋白浓度)毫克/毫升=单位/毫克
单位=微摩尔果糖-6-磷酸/分钟
六、 酶标板测定
1. 在96孔酶标板上做好相应标记:背景对照和样品
2. 分别移取195微升缓冲液(Reagent C)到96孔板中的所有孔中
3. 分别加入25微升底色液(Reagent D)
4. 分别加入25微升反应液(Reagent E)
5. 轻轻摇动96孔酶标板 3
6. 在25℃温度下孵育3分钟
7. 分别加入5微升阴性液(Reagent F)或待测样品(20微克蛋白)到相应孔中(注意:样品须清澈)
8. 轻轻摇动酶标板
9. 即刻放进酶标仪检测:0分钟读数和5分钟读数
10.活性计算
[(样品读数-背景读数)X样品稀释倍数X 0.25(毫升,测定体系)]÷[0.005(样品容量,毫升)X 6.22(毫摩尔吸光系数)X 0.6(厘米)X 5(分钟)X 2]=单位/毫升÷(样品蛋白浓度)毫克/毫升=单位/毫克
单位=微摩尔果糖-6-磷酸/分钟
注意事项
1. 本产品为20次(比色皿)和80次(酶标板)操作,包括背景对照
2. 操作时,须戴手套
3. 系统操作过程中,背景测定只需1次
4. 建议使用比色皿测定
5. 样品须澄清,至关重要
6. 加样后3秒内光谱测定
7. 测定值由高到低变化;测定可持续5分钟
8. 光谱测定后,比色皿须清洗彻底
9. 样本测定0分钟读数高于5分钟读数表明具有酶活性
10.建议待测样本蛋白浓度为20微克/20微升;如果样本酶活性过低或过高, 则可以增加或降低样本量(本公司提供 YYBradford蛋白质浓度定量试剂盒-YY30030.1)
11.如果待测样品浓度过高或过低,可以调整样品浓度
12.磷酸果糖激酶单位活性定义为:在25℃,pH 7.8条件下,每分钟内能够转化1微摩尔果糖-6-磷酸和ATP至果糖-1,6-二磷酸所需的酶量作为一个活性单位
13.本公司提供系列经典细胞激酶检测试剂产品
质量标准
1. 本产品经鉴定性能稳定
2. 本产品经鉴定检测敏感