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组织多聚ADP核糖聚合酶-1活性比色法定量检测试剂盒

 发布时间:2017-01-18 点击量:120

组织多聚ADP核糖聚合酶-1活性比色法定量检测试剂盒

产品说明书

 

主要用途

 

组织多聚ADP核糖聚合酶-1(PARP-1)活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过人工合成底物ADP核糖对硝基苯酚,受到PARP-1的作用,释放出显色产物对硝基苯酚,出现吸光峰值的变化即采用比色法来测定组织裂解样品中酶活性而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的其适用于各种组织裂解悬液样品(动物、人体等)多聚ADP核糖聚合酶-1的活性检测,以及抑制剂筛选。产品严格无菌,即到即用,操作简捷,性能稳定。

 

技术背景

 

多聚ADP核糖聚合酶-1(Poly (ADP-ribose) PolymerasePARPEC 2.4.2.30)是一种锌依赖性核酶,广泛存在于真核细胞中。PARP家属由18个成员,其中6个已经被证实,包括PARP-1(占90%)、PARP-2、PARP-4(VPARP)、PARP-/5b(tankyrase)等。PARP蛋白由4个结构域构成:DNA结合、切离、自修饰(automodification)、催化等结构域。其功能在于特异性地识别DNA损伤产生的单链或双链DNA断裂,并与之结合而激活,催化将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotideNAD)转化烟酰胺nicotinamide和多聚ADP核糖分枝聚合体(branched polymers of various poly (ADP-ribose))的反应,由此导各种DNA修复蛋白聚集到损伤部位,实施修复,同时调节染色质结构形成(chromatin structure formation)、 细胞分化、繁殖、发育、凋亡、基因表达等,以及对于心脑缺血的反应和肿瘤恶变的作用。抑制PARP活性,可以防止心衰、中风、败血症等引起的组织损害。基于人工合成底物ADP核糖对硝基苯酚(ADP-ribose-p-nitrophenol),在损伤的DNA存在的前提下,受到多聚ADP核糖聚合酶-1的作用,释放出显色产物对硝基苯酚(p-nitrophenol),通过分光光度仪检测吸光读数的变化405nm 波长,来定量分析多聚ADP核糖聚合酶-1的活性。反应系统为:

 

 

产品内容

 

清理液(Reagent A)

毫升

裂解液(Reagent B)

毫升

缓冲液(Reagent C)

毫升

反应液(Reagent D)

微升

底物液(Reagent E)

微升

阴性液(Reagent F)

微升

说明书

1份

 

保存方式

 

保存 裂解液(Reagent B)、 反应液(Reagent D)和 底物液(Reagent E)在-20冰箱里其余的保存在4冰箱里; 底物液(Reagent E)避免光照;有效保证6

 

用户自备

 

1.5毫升离心管:用于样品制备和保存的容器

15毫升锥形离心管:用于样品制备的容器

(微型)台式离心机:用于样品制备

比色皿或酶标板:用于比色的容器

分光光度仪或酶标仪:用于比色分析

 

实验步骤

 

实验开始前,将-20℃冰箱里的试剂盒中的 裂解液(Reagent B置入冰槽里融化。然后进行下列操作。

 

  • 样品准备

 

  • 手术取出动物组织,并秤重以确定500毫克组织重量 
  • (选择步骤)放进预冷的15毫升锥形离心管
  • (选择步骤)加入xx毫升 清理液(Reagent A)清洗1次
  • 移入到一个液氮冻存管
  • 即刻放进液氮罐过一夜
  • 次日从液氮罐里取出,即刻(快速度)用研磨棒碾碎组织成粉末状(注意:切莫使组织冻融)
  • 放进一个15毫升锥形离心管
  • 加入预冷的xx微升 裂解液(Reagent B) 
  • 转移到预冷的1.5毫升离心管
  • 强力涡旋震荡30秒,充分混匀
  • 置于冰槽里孵育30分钟,期间每10分钟强力涡旋震荡30秒(注意:需暂时停止,放进-70冰箱里储存备用)
  • 放进4微型台式离心机离心5分钟,速度为16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415)
  • 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
  • 移取10微升进行蛋白定量检测
  • 即刻放进-70保存或置于冰槽里继续后续操作

 

  • 测定准备

 

  • 开启并设定好分光光度仪(温度为25℃):波长405nm,并置零 
  • 从-20℃冰箱里取出试剂置于冰槽里融化; 底物液(Reagent E避免光照 缓冲液(Reagent C室温下预热

 

  • 背景对照测定

 

  • 移取xx微升 缓冲液(Reagent C到新的比色皿
  • 加入xx微升 反应液(Reagent D
  • 加入xx微升 底物液(Reagent E
  • 加入xx微升 阴性液(Reagent F
  • 上下倾倒数次,混匀
  • 25℃温度下孵育2小时
  • 即刻放进分光光度仪检测,此为背景读数

 

  • 样品测定

 

  • 移取xx微升 缓冲液(Reagent C到新的比色皿
  • 加入xx微升 反应液(Reagent D
  • 加入xx微升 底物液(Reagent E
  • 加入5微升待测样品(100微克蛋白)(注意:样品须清澈)
  • 上下倾倒数次,混匀
  • 25℃温度下孵育2小时
  • 即刻放进分光光度仪检测,此为样品读数

 

五、计算样品活性

 

 

  • 酶标板测定

 

  • 96孔酶标板上做好相应标记:背景对照和样品
  • 分别移取xx微升 缓冲液(Reagent C到96孔板中
  • 分别加入xx微升 反应液(Reagent D
  • 分别加入xx微升 底物液(Reagent E
  • 分别加入xx微升 阴性液(Reagent F待测样品(100微克蛋白)到相应孔中(注意:样品须清澈)
  • 轻轻摇动酶标板
  • 25℃温度下孵育2小时
  • 即刻放进酶标仪检测:获得背景读数和样品读数
  • 活性计算:

 

 

注意事项

 

  • 本产品为20次操作,包括背景对照
  • 操作时,须戴手套
  • 系统操作过程中,背景测定只需1
  • 样品须澄清,至关重要 
  • 测定值由低到高变化;反应可持续2小时
  • 比色测定后,比色皿须清洗彻底
  • 样本测定2小时读数高于背景读数表明具有酶活性
  • 建议待测样本蛋白浓度为100微克/5微升
  • 如果待测样品浓度过高或过低,可以调整样品浓度
  • 多聚ADP核糖聚合酶-1单位活性定义为:在25℃,pH 8.0条件下,每小时内能够释放1微摩尔对硝基苯酚所需的酶量作为一个活性单位
  • 本公司提供系列乙醇代谢酶类检测试剂产品

 

质量标准

 

  • 本产品经鉴定性能稳定
  • 本产品经鉴定检测敏感