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细胞肉毒碱棕榈酰转移酶I活性比色法定量检测试剂盒

 发布时间:2017-01-18 点击量:184

细胞肉毒碱棕榈酰转移酶I活性比色法定量检测试剂盒

说明书

 

主要用途

 

细胞肉毒碱棕榈酰转移酶I(CARNITINE PALMITOYL-TRANSFERASE I)活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过肉碱脂酰辅酶A以及特定抑制剂反应系统中释放出巯基辅酶A,使用Ellman试剂,产生黄色5-巯基-2-硝基苯甲酸产物吸光峰值的变化即采用比色法来测定细胞裂解样品中酶活性而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的其适用于各种细胞裂解悬液样品(动物、人体等)肉毒碱棕榈酰转移酶I的特异活性检测。产品严格无菌,即到即用,操作简捷,性能稳定。

 

技术背景

 

脂肪酸β氧化过程(β-oxidation)在动物组织的线粒体发生的脂肪酸代谢通路,可概括为活化、转移、β氧化及后经三羧酸循环被彻底氧化生成CO2H2O并释放能量等四个阶段。大于10个碳(C10)的活化型长链脂酰辅酶A是不能直接透过线粒体内膜,需要借助肉碱(camitine),即L-3-4-三甲基铵丁酸,被转运入线粒体内,在线粒体内膜的外侧及内侧分别有肉碱脂酰转移酶(carnitine palmitoyl transferase;CPT;EC2.3.1.21)I。位于内膜外侧的酶,促进脂酰CoA转化为脂酰肉碱,后者可借助线粒体内膜上的转位酶(或载体),转运到内膜内侧,然后,在酶催化下脂酰肉碱释放肉碱到胞浆留下脂酰CoA。由此位于胞活化脂肪酸―脂酰CoA穿过线粒体内膜进入基质而被氧化分解。肉碱脂酰转移酶缺失症导致机体无法代谢脂肪酸。基于肉碱脂酰辅酶A丙二酰辅酶Amalonyl CoA)存在与否的条件下,通过肉碱脂酰转移酶的作用,产生脂酰肉碱,并释放出巯基辅酶A(CoA-SH),与Ellman试剂5,5-二硫基-2-硝基苯甲酸[5,5-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid);DTNB]反应后,产生黄色的5-巯基-2-硝基苯甲酸(5-thio-2-nitrobenzoic acid;TNB),通过其吸收峰值的变化412nm波长,来定量分析丙二酰辅酶A敏感性肉碱脂酰转移酶I的特异活性。肉碱脂酰转移酶I反应系统为:

 

 

产品内容

 

清理液(Reagent A)

毫升

裂解液(Reagent B)

毫升

缓冲液(Reagent C)

毫升

反应液(Reagent D)

毫升

底物液(Reagent E)

毫升

抑制液(Reagent F)

微升

说明书

1份

 

保存方式

 

保存缓冲液(Reagent C)、反应液(Reagent D)和底物液(Reagent E)、抑制液(Reagent G)在-20冰箱里其余的保存在4冰箱里;反应液(Reagent D)、底物液(Reagent E)和抑制液(Reagent G)避免光照;有效保证6

 

用户自备

 

1.5毫升离心管:用于样品操作的容器

15毫升锥形离心管:用于样品制备的容器

细胞刮脱棒:用于贴壁细胞脱离

比色皿或96孔板:用于比色的容器

分光光度仪或酶标仪:用于比色分析

 

实验步骤

 

  • 样品准备(总蛋白制备)

 

  • 准备好25cm2细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞(15 X 106细胞)
  • 小心加入xx毫升清理液(Reagent A,覆盖生长表面
  • 小心抽去清理液
  • 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞(注意:可以使用胰酶消化
  • 加入xx毫升清理液(Reagent A,混匀细胞
  • 移入到预冷的15毫升锥形离心管(注意:悬浮细胞从这一步骤开始
  • 放进4℃台式离心机离心5分钟,速度为300g
  • 小心抽去上清液
  • 加入xx微升裂解液(Reagent B,充分混匀
  • 转移到预冷的1.5毫升离心管
  • 强力涡旋震荡15
  • 置于冰槽里孵育30分钟
  • 放进4℃微型台式离心机离心5分钟,速度为16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415
  • 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
  • 移取10微升进行蛋白定量检测
  • 即刻放进-70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

 

  • 测定准备

 

  • 开启并设定好分光光度仪(温度为25℃):波长412nm,间隔5分钟,读数4次(共15分钟),并置零 
  • 从-20℃冰箱里取出试剂置于冰槽里融化;反应液(Reagent D底物液(Reagent E避免光照缓冲液(Reagent C室温下预热

 

 

  • 样品总活性背景对照测定

 

  • 移取xx微升缓冲液(Reagent C到新的比色皿
  • 加入xx微升底物液(Reagent E
  • 25℃温度下孵育3分钟
  • 加入10微升待测样品(50微克蛋白)(注意:样品须清澈 
  • 上下倾倒数次,混匀(限定在3秒之内)
  • 即刻放进分光光度仪检测,此为样品总活性背景空对照(15分钟读数-0分钟读数)

 

  • 样品总活性测定

 

  • 移取xx微升缓冲液(Reagent C到新的比色皿
  • 加入xx微升反应液(Reagent D
  • 加入xx微升底物液(Reagent E
  • 25℃温度下孵育3分钟
  • 加入10微升待测样品(50微克蛋白)(注意:样品须清澈
  • 上下倾倒数次,混匀(限定在3秒之内)
  • 即刻放进分光光度仪检测,此为样品总活性读数15分钟读数-0分钟读数) 

 

  • 样品非特异活性背景对照测定

 

  • 移取xx微升缓冲液(Reagent C到新的比色皿
  • 加入xx微升底物液(Reagent E
  • 加入xx微升抑制液(Reagent F
  • 25℃温度下孵育3分钟
  • 加入10微升待测样品(50微克蛋白)(注意:样品须清澈 
  • 上下倾倒数次,混匀(限定在3秒之内)
  • 即刻放进分光光度仪检测,此为样品非特异活性背景空对照(15分钟读数-0分钟读数)

 

六、样品非特异活性测定

 

检测开始前,分别移取xx微升抑制液(Reagent F和待测样品(注意:50微克蛋白到1.5毫升离心管,混匀后,25℃温度下孵育15分钟。然后继续下列操作。

 

  • 移取xx微升缓冲液(Reagent C到新的比色皿
  • 加入xx微升反应液(Reagent D
  • 加入xx微升底物液(Reagent E
  • 25℃温度下孵育3分钟
  • 加入20微升上述预处理的待测样品
  • 上下倾倒数次,混匀(限定在3秒之内)
  • 即刻放进分光光度仪检测,此为样品非特异活性读数(15分钟读数-0分钟读数)

 

 

 

七、计算样品活性

 

  • 样品活性(总活性或非特异活性)

 

 

单位=微摩尔辅酶A /分钟

 

  • 样品CPT I特异活性

 

  • 酶标测定

 

  • 样品总活性检测

 

  • 96孔板上做好相应标记:背景对照和待测样品
  • 分别移取xx微升缓冲液(Reagent C到96孔板所有孔里
  • 加入xx微升缓冲液(Reagent C到背景对照孔里
  • 加入xx微升反应液(Reagent D到待测样品孔里
  • 分别加入xx微升底物液(Reagent E到96孔板所有孔里
  • 25℃温度下孵育3分钟
  • 分别加入10微升待测样品(50微克蛋白)所有(注意:样品须清澈
  • 轻轻摇动酶标板
  • 即刻放进酶标仪检测:0分钟读数和15分钟读数
  • 活性计算:

 

 

  • 样品非特异性活性检测

 

检测开始前,分别移取xx微升抑制液(Reagent F和待测样品(注意:50微克蛋白到1.5毫升离心管,混匀后,25℃温度下孵育15分钟。然后继续下列操作。

 

  • 96孔板上做好相应标记:背景对照和待测样品
  • 分别移取xx微升缓冲液(Reagent C到96孔板所有孔里
  • 加入xx微升缓冲液(Reagent C到背景对照孔里
  • 加入xx微升反应液(Reagent D到待测样品孔里
  • 分别加入xx微升底物液(Reagent E到96孔板所有孔里
  • 在25℃温度下孵育3分钟
  • 分别加入20微升上述预处理的待测样品背景对照和待测样品孔里
  • 轻轻摇动酶标板
  • 即刻放进酶标仪检测:0分钟读数和15分钟读数
  • 活性计算:

 

 

  • 样品CPT I特异性活性计算

 

样品总活性-样品非特异活性=样品CPT I特异活性

 

注意事项

 

  • 本产品为20次操作,包括背景对照
  • 操作时,须戴手套
  • 系统操作过程中,背景测定只需1
  • 建议使用纯化线粒体(10微克)作为待测样品为佳
  • 建议使用比色皿测定
  • 样品须澄清,至关重要 
  • 加样后3秒内比色测定
  • 测定值由低到高变化;测定可持续15分钟
  • 比色测定后,比色皿须清洗彻底
  • 样本测定15分钟读数高于0分钟读数表明具有酶活性
  • 如果待测样本为总蛋白,其蛋白浓度为50微克/10微升
  • 如果待测样品浓度过高或过低,可以调整样品浓度
  • 肉毒碱棕榈酰转移酶I单位活性定义为:在25℃,pH 7.4条件下,每分钟内能够释放1微摩尔辅酶A所需的丙二酰辅酶敏感性酶量作为一个活性单位
  • 本公司提供系列脂肪酸代谢检测试剂产品

 

质量标准

 

  • 本产品经鉴定性能稳定
  • 本产品经鉴定检测敏感