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氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)浓度比色法定量检测试剂盒

 发布时间:2017-01-18 点击量:248

氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD浓度比色法定量检测试剂盒

产品说明书

 

主要用途

 

氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD浓度比色法定量检测试剂是一种旨在通过乙醇脱氢酶反应系统测定细胞或组织样品中的氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD还原后吸光峰值的变化,即采用比色法测定NAD含量的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的其适用于各种细胞或组织裂解悬液样品(动物、人体、植物、昆虫等)氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD的浓度检测。产品严格无菌,即到即用,操作简捷,性能稳定。

 

技术背景

 

氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(oxidized nicotinamide adenine dinucleotide;NAD)是脱氢酶的辅酶,例如乙醇脱氢酶(ethanol dehydrogenase),存在于所有生物体细胞中。在糖酵解通路中接受质子(氢离子)转化为还原烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide;NADH,提供电子。是细胞生理学中呼吸链能量代谢、脂肪酸代谢和糖代谢(糖酵解、糖异生)的重要因子。基于底物乙醇(ethanol)乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase)的催化反应中,产生乙醛(acetaldehyde),伴随着NAD还原转化为NADH,发生吸光峰值的变化,在分光光度仪下340nm 波长)测定样品中NAD的浓度。其反应方式为

 

产品内容

 

缓冲液(Reagent A)

毫升

反应液(Reagent B)

毫升

阴性液(Reagent C)

毫升

酶促液(Reagent D)

毫升

标准液(Reagent E)

毫升

产品说明书

1份

 

保存方式

 

保存反应液(Reagent B)、酶促液(Reagent D)和标准液(Reagent E)在-20冰箱里,避免光照;其余的保存在4冰箱里,有效保证12

 

用户自备

 

比色或酶标板:用于比色分析的容器

分光光度仪或酶标仪:用于比色分析

 

 

 

实验步骤

 

实验开始前,将-20℃冰箱里的试剂盒中的反应液(Reagent B酶促液(Reagent D标准液(Reagent E置入冰槽里融化,避免光照。然后进行下列操作。

 

  • 测定准备

 

  • 准备好待测NAD的样品(例如细胞裂解萃取液样品等),置于冰槽里
  • 设定好分光光度仪(温度为25℃):波长340nm 
  • 缓冲液(Reagent A室温下均衡温度

 

二、背景对照测定

 

  • 移取xx微升缓冲液(Reagent A到新的比色皿
  • 加入xx微升反应液(Reagent B
  • 加入xx微升阴性液(Reagent C
  • 上下倾倒数次,混匀
  • 置于25℃温度下孵育3分钟,避免光照
  • 即刻放进分光光度仪检测,此为背景0分钟读数
  • 加入xx微升酶促液(Reagent D
  • 上下倾倒数次,混匀
  • 置于25℃温度下孵育5分钟,避免光照
  • 即刻放进分光光度仪检测,此为背景5分钟读数
  • 背景实际读数5分钟读数-0分钟读数 

 

  • 标准样品测定

 

  • 准备好5管标准液Reagent E,标准管浓度见下表:

 

管号

标准液Reagent E

测定体系NADH终浓度

A

xx毫摩尔/升

xx微摩尔/升

B

xx毫摩尔/升

xx微摩尔/升

C

xx毫摩尔/升

xx微摩尔/升

D

xx毫摩尔/升

xx微摩尔/升

E

xx微摩尔/升

xx微摩尔/升

 

  • 移取xx微升缓冲液(Reagent A到新的比色皿
  • 加入xx微升反应液(Reagent B
  • 加入xx微升标准液(Reagent E 
  • 上下倾倒数次,混匀
  • 置于25℃温度下孵育3分钟,避免光照
  • 即刻放进分光光度仪检测,此为标准样品0分钟读数
  • 加入xx微升酶促液(Reagent D
  • 上下倾倒数次,混匀
  • 置于25℃温度下孵育5分钟,避免光照
  • 即刻放进分光光度仪检测,此为标准样品5分钟读数
  • 标准样品实际读数5分钟读数-0分钟读数
  • 重复实验步骤212,直至测完所有上述配制的5管标准样品

 

  • 样品测定

 

  • 移取xx微升缓冲液(Reagent A到新的比色皿
  • 加入xx微升反应液(Reagent B
  • 加入100微升(20微克蛋白)待测样品(注意:样品须清澈
  • 上下倾倒数次,混匀
  • 置于25℃温度下孵育3分钟,避免光照
  • 即刻放进分光光度仪检测,此为样品0分钟读数
  • 加入xx微升酶促液(Reagent D
  • 上下倾倒数次,混匀
  • 置于25℃温度下孵育3分钟,避免光照
  • 即刻放进分光光度仪检测,此为样品5分钟读数
  • 样品实际读数:5分钟读数-0分钟读数

 

五、计算样品浓度

 

  • 构建测定体系NAD浓度标准曲线:纵座标(Y)为吸光值OD340,横座标(X)为NAD浓度(微摩尔/升
  • 根据标准曲线获得样品对应NAD浓度
  • 计算样品实际NAD浓度

 

 

  • 酶标板测定

 

  • 96孔酶标板上做好相应标记:背景对照、标准样品和待测样品
  • 分别移取xx微升缓冲液(Reagent A所有孔中
  • 分别加入xx微升反应液(Reagent B所有孔中
  • 分别加入xx微升阴性液(Reagent Cxx管配制的标准液(Reagent E、待测样品(10微克蛋白)到对应孔中
  • 轻轻摇动酶标板,混匀
  • 置于25℃温度下孵育3分钟,避免光照
  • 即刻放进酶标仪检测,此为背景、标准样品或待测样品0分钟读数
  • 分别加入xx微升酶促液(Reagent D所有孔中
  • 轻轻摇动酶标板,混匀
  • 置于25℃温度下孵育5分钟,避免光照
  • 即刻放进酶标仪检测,此为背景、标准样品或待测样品5分钟读数
  • 实际读数5分钟读数-0分钟读数
  • 计算样品浓度

 

  • 构建NAD浓度标准曲线:纵座标(Y)为吸光值OD340,横座标(X)为NAD浓度(微摩尔/升
  • 根据标准曲线获得样品对应NAD浓度
  • 计算样品实际NAD浓度

 

 

注意事项

 

  • 本产品为25次(比色皿)和100次(酶标板)操作,包括背景对照、标准样品
  • 操作时,须戴手套
  • 系统操作过程中,背景和标准测定只需1次
  • 样品须澄清,至关重要
  • 孵育时,避免光照
  • 加样后即刻比色测定
  • 反应1分钟后比色测定值趋于稳定;测定值由变化;测定持续5分钟
  • 比色测定后,比色皿须清洗彻底
  • 如果待测样品浓度过高或过低,可以调整样品浓度
  • 本公司提供系列生化检测试剂产品

 

质量标准

 

  • 本产品经鉴定性能稳定
  • 本产品经鉴定检测敏感