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体液羟脯氨酸比色法定量检测试剂盒

 发布时间:2017-01-18 点击量:216

体液羟脯氨酸比色法定量检测试剂盒

产品说明书

 

主要用途

 

体液羟脯氨酸(hydroxyproline)比色法定量检测试剂是一种旨在通过酸性分解后的羟脯氨酸,氧化后与欧利希氏试剂反应,产生产物,由分光光度仪比色分析,定量检测组织样品羟脯氨酸含量,评价胶原蛋白水平的而经典的技术方法。该技经过精心改良韦斯纳Woessner)方法、成功实验证明的。适用于各种体液包括血浆、血清、脑脊液、唾液、精液等羟脯氨酸或胶原蛋白水平检测产品严格无菌,即到即用,操作简捷,性能稳定,检测准确

 

技术背景

 

蛋白质结构中存在着两种肽键(peptide bond)形式:氢原子肽键和亚氨肽键(imidopeptide bond)。后者为脯氨酸或羟脯氨酸的杂环氮原子(heterocyclic nitrogen atom)肽键。超过25%脯氨酸和羟脯氨酸构成的胶原蛋白(占人体30%蛋白总量)和明胶蛋白的肽键是杂环氮原子肽键。它们是结缔组织的主要构架蛋白,以提供组织的耐久性。羟脯氨酸(hydroxyproline;HYP)的检测常用于评价组织胶原蛋白的水平。基于含有胶原蛋白的组织蛋白在酸性水解后释放的羟脯氨酸,氯胺TChloramine T对甲苯氯磺醯胺钠盐)氧化后,其产物吡咯-2-羧酸pyrrole-2- carboxylate;PCA)欧利希氏试剂(Ehrlich’ reagent偶氮染料二甲基-4-氨基苯甲醛(4-(dimethylamino) benzaldehyde;DMBA)的作用下,产生红色产物,通过分光光度仪(550nm波长),测定羟脯氨酸的含量。据此评价胶原蛋白的水平其反应系统为:

 

 

产品内容

 

清理液(Reagent A)

毫升

水解液(Reagent B)

毫升

中和液(Reagent C)

毫升

缓冲液(Reagent D)

毫升

氧化液(Reagent E)

毫升

终止液(Reagent F)

毫升

显色液(Reagent G)

稀释液(Reagent H)

毫升

标准液(Reagent I)

毫升

说明书

1份

 

保存方式

 

保存氧化液(Reagent E在-20冰箱里,避免光照;其余的保存在4冰箱里,水解液(Reagent B)、中和液(Reagent C和终止液(Reagent F具有腐蚀性,严格注意操作安全;显色液(Reagent G,避免光照;有效保证6

 

用户自备

 

1.5毫升离心管:用于标准液、反应液配制和样品制备的容器

培养箱:用于反应孵育

烘箱或电炉:用于样品制备

离心干燥仪:用于甩干样品

比色皿:用于比色分析的容器

分光光度仪:用于比色分析

 

实验步骤

 

  • 样品准备

 

选择一:血浆样品

  • 准备好肝素或ACD抗凝管(注意:避免使用EDTA抗凝管)
  • 抽取1毫升血液,置于抗凝管里
  • 放进4℃微型台式离心机离心10分钟,速度为700g(或3000RPM,例如eppendorf 5415)
  • 小心移取上层黄色液体到新的1.5毫升离心管――此为血浆成分(注意:避免触碰白色液体层
  • 即刻置于冰槽里备用或放进-70℃冰箱里保存
  • (选择步骤)移取10微升进行蛋白定量检测
  • (选择步骤)加入适量的清理液(Reagent A)调整蛋白浓度或稀释样品

 

选择二:血清样品

1. 准备好不含抗凝剂的储存管

  • 抽取1毫升血液,置于储存管里
  • 室温下,静置30分钟,直至血液凝结
  • 放进4℃微型台式离心机离心15分钟,速度为2000g(或5000RPM,例如eppendorf 5415)
  • 小心移取上层黄色液体到新的1.5毫升离心管――此为血清成分(注意:避免触碰白色液体层
  • 即刻置于冰槽里备用或放进-70℃冰箱里保存
  • (选择步骤)移取10微升进行蛋白定量检测
  • (选择步骤)加入适量的清理液(Reagent A)调整蛋白浓度或稀释样品

 

选择三:脑脊液/唾液/精液样品 

  • 准备好1.5毫升离心管
  • 移取1毫升液体到离心管
  • 放进4℃微型台式离心机离心10分钟,速度为700g(或3000RPM,例如eppendorf 5415)
  • 小心移取上清液到新的1.5毫升离心管
  • 即刻置于冰槽里备用或放进-70℃冰箱里保存
  • (选择步骤)移取10微升进行蛋白定量检测

 

二、样品预处理  

 

  • 移取上述制备的的20微升待测样品到1.5毫升离心管
  • 加入xx微升水解液(Reagent B)
  • 涡旋震荡5秒,充分混匀
  • 煮沸3小时(注意:小心盖子爆开,严格遵守操作安全)
  • (选择步骤)或者置于120烘箱孵育过一夜(注意:避免液体干枯
  • 室温下冷却15分钟
  • 加入xx微升中和液(Reagent C),混匀(注意:严格遵守操作安全
  • (选择步骤)或者置于离心干燥机干燥处理
  • (选择步骤)加入400微升缓冲液(Reagent D),混匀
  • 即刻放进-20保存或置于冰槽里继续后续操作

 

三、标准样品配制

 

  • 准备好51.5毫升离心管,标记为15号管
  • 分别加入xx微升缓冲液(Reagent D15号管
  • 移取xx微升标准液(Reagent I1号管,混匀
  • 小心移取xx微升1号管稀释标准液(Reagent I2号管,混匀
  • 小心移取xx微升2号管稀释的标准液(Reagent I3号管,混匀
  • 小心移取xx微升3号管稀释的标准液(Reagent I4号管,混匀
  • 15号管放进冰槽里备用;标准管浓度见下表

 

管号

缓冲液(Reagent D

标准液(Reagent I

标准羟脯氨酸含量

1

xx微升

xx微升

xx微克

2

xx微升

xx微升1号管

xx微克

3

xx微升

xx微升2号管

xx微克

4

xx微升

xx微升3号管

xx微克

5

xx微升

0

0

 

四、标准曲线测定

 

测定开始前,移出xx毫稀释液(Reagent Hxx管 显色液(Reagent G放进60恒温水槽孵育直至溶解澄清标记为反应工作液(注意:如果出现乳状浑浊,再次放进60恒温水槽孵育直至澄清后,即刻加入反应体系中)。然后进行下列操作。

 

  • 加入xx微升上述配制的标准液(Reagent I到新的比色皿
  • 加入xx微升氧化液(Reagent E),用枪头混匀
  • 室温下,孵育20分钟
  • 加入xx微升终止液(Reagent F)
  • 加入xx微升反应工作液,用枪头混匀
  • 在60恒温水槽孵育15分钟,避免光照
  • 即刻放进分光光度仪检测(波长550nm):获得标准样品吸光读数
  • 重复实验步骤17四次
  • 构建标准曲线:纵座标(Y轴)为吸光读数;横座标(X轴)为标准羟脯氨酸含量微克

 

  • 样品测定

 

测定开始前,移出xx毫稀释液(Reagent Hxx管 显色液(Reagent G放进60恒温水槽孵育直至溶解澄清标记为反应工作液(注意:如果出现乳状浑浊,再次放进60恒温水槽孵育直至澄清后,即刻加入反应体系中)。然后进行下列操作。

 

  • 加入400微升上述制待测样品到新的比色皿
  • 加入xx微升氧化液(Reagent E),用枪头混匀
  • 室温下,孵育20分钟
  • 加入xx微升终止液(Reagent F)
  • 加入xx微升反应工作液,用枪头混匀
  • 在60恒温水槽孵育15分钟,避免光照
  • 即刻放进分光光度仪检测(波长550nm):获得样品吸光读数

 

  • 浓度计算

 

 

注意事项

 

  • 本产品为25次操作,包括标准样品
  • 操作时,须戴手套
  • 系统操作时,标准样品测定只需1次
  • 水解液(Reagent B)中和液(Reagent C终止液(Reagent F具有腐蚀性,严格注意操作安全
  • 反应工作液配制后,即刻使用,不宜存放
  • 反应工作液配制后,出现乳状浑浊,再次放进60恒温水槽孵育直至澄清后,即刻加入反应体系中
  • 孵育时,避免光照
  • 胶原蛋白平均含有13.5%羟脯氨酸
  • 本公司提供系列胶原蛋白代谢检测试剂产品

 

 

质量标准

 

  • 本产品经鉴定性能稳定
  • 本产品经鉴定检测敏感