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细胞CDK1/CYCLINB激酶活性荧光共振转移法定量试剂盒

 发布时间:2017-01-18 点击量:1186

细胞CDK1/CYCLINB激酶活性荧光共振能量转移法定量检测试剂盒

产品说明书

主要用途

细胞CDK1/CYCLIN B激酶活性荧光共振能量转移法(FRET)定量检测试剂是一种旨在通过荧光探针EDANS供体和DABCYL受体双重标记的多肽底物,在CDK1/CYCLIN B的磷酸化后,不能被位点特异性氨基肽酶切离,而发生荧光峰值的降低,即采用荧光共振能量转移法来测定样品中酶活性的而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞裂解萃取液样品(动物、人体)、部分或完全纯化酶样品中CDK1/CYCLIN B激酶的定量检测,以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌,即到即用,操作简捷,性能稳定,安全可靠。

 

技术背景

细胞周期素依赖性激酶1(cyclin dependent kinase 1;CDK1),又称为细胞分裂周期蛋白2(cell division cycle2;CDC2)或p34cdk1,属于丝氨酸/苏氨酸激酶(serine/threonine protein kinase)家属成员之一。其为高度进化保留的激酶复合物,成熟促进因子(maturation promoting factor;MRF)中的催化亚体,含有297氨基酸,与细胞周期素B结合,允许细胞由G2期进入有丝分裂期以及由G1期进入DNA合成期,达到调节细胞生长、DNA复制、细胞分裂等。其磷酸化目标序列为 GGGRSPGRRRRK。基于磷酸化多肽具有抗氨基肽酶切离的功能,通过荧光共振能量转移法(Fluorescence resonance energy transfer;FRET),即传递激发状态的能量由处于较短波长的供体(donor)到覆盖供体波长的受体(acceptor),使得距离依赖性反应的供体的散发光子淬灭(quench),使用2个荧光探针EDANS供体和DABCYL受体作为FRET对,来标记的CDK1多肽底物的两端,在氨基肽酶(aminopeptidase)的作用下,释放出强烈荧光的EDANS;一旦底物受到CDK1的磷酸化(由ATP的γ-磷酸根到多肽上单一丝氨酸残基分子上),底物将不能被位点特异性氨基肽酶切离,而无法释放出EDANS,由此根据产物荧光强度(激发波长340nm,散发波长490nm)的降低,来定量测定细胞周期素依赖性激酶1的活性。细胞周期素依赖性激酶1反应系统为:

 

产品内容

清理液(Reagent A)

毫升

裂解液(Reagent B)

毫升

缓冲液(Reagent C)

毫升

底物液(Reagent D)

微升

反应液(Reagent E)

微升

酶解液(Reagent F)

微升

终止液(Reagent G)

微升

标准液(Reagent H)

微升

磷酸化底物液(Reagent I)

微升(另购)

说明书

1份

 

保存方式

保存 清理液(Reagent A)和 裂解液(Reagent B)在4℃冰箱里,其余的保存在-20℃

冰箱里;底物液(Reagent D)和标准液(Reagent H)避免光照,有效保证6 月

 

用户自备

CDK1/CYCLIN B 激酶:用于抑制剂筛选

磷酸化底物液(Reagent I):用于测定样品磷酸化程度的反应试剂

1.5 毫升离心管:用于标准样品操作和样品保存的容器

15 毫升锥形离心管:用于样品操作的容器

细胞刮脱棒:用于贴壁细胞脱离

(微型)台式离心机:用于细胞预处理

黑色酶标板:用于反应和比色的容器

荧光酶标仪:用于荧光分析

 

实验步骤

实验开始前,将-20℃冰箱里的试剂置入冰槽里融化。然后进行下列操作。

 

一、样品准备

1. 准备好 25cm2细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞(1 至5 X 106细胞)

2. 小心加入 xx 毫升  清理液(Reagent A),覆盖生长表面

3. 小心抽去清理液

4. 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞(注意:避免使用胰酶消化)

5. 加入 xx 毫升  清理液(Reagent A),混匀细胞

6. 移入到预冷的 15 毫升锥形离心管(注意:悬浮细胞从这一步骤开始)

7. 放进 4℃台式离心机离心5 分钟,速度为300g

8. 小心抽去上清液

9. 加入 xx 微升  裂解液(Reagent B),充分混匀

10.转移到预冷的1.5 毫升离心管

11.强力涡旋震荡15 秒

12.置于冰槽里孵育30 分钟

13.放进4℃微型台式离心机离心5 分钟,速度为16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415)

14.小心移取500 微升上清液到新的预冷的1.5 毫升离心管

15.移取10 微升进行蛋白定量检测

16.即刻放进-70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

 

二、 测定准备

1. 准备好待测样品(例如细胞裂解萃取液或纯化酶样品等),置于冰槽里

2. 设定好荧光酶标仪(温度为 25℃):激发波长360nm,散发波长490nm,并置零

3. 准备好 5 个1.5 毫升离心管,标记为1 至5 号管

2

4. 加入xx微升 缓冲液(Reagent C)到1号管

5. 分别加入xx微升 缓冲液(Reagent C)到2至5号管

6. 移取xx微升 标准液(Reagent H)到1号管,混匀

7. 小心移取xx微升1号管稀释的 标准液(Reagent H)到2号管,混匀

8. 小心移取xx微升2号管稀释的 标准液(Reagent H)到3号管,混匀

9. 小心移取xx微升3号管稀释的 标准液(Reagent H)到4号管,混匀

10.将1至5号管放进冰槽里备用;标准管浓度见下表

管号

缓冲液(Reagent C)

标准液(Reagent H)

标准EDANS浓度

1

微升

微升

微摩尔/升

2

微升

微升1号管

微摩尔/升

3

微升

微升2号管

微摩尔/升

4

微升

微升3号管

微摩尔/升

5

微升

0

0

 

三、荧光测定

 

(一)活性测定

1. 在96孔酶标板上做好相应标记:标准样品和待测样品

2. 分别移取xx微升 缓冲液(Reagent C)到相应孔中

3. 分别加入xx微升 底物液(Reagent D)

4. 分别加入xx微升上述配制的标准液或待测样品(20微克纯化酶或100微克细胞裂解萃取液蛋白)(注意:样品须清澈)

5. 分别加入xx微升 反应液(Reagent E)

6. 轻轻摇动96孔酶标板30秒

7. 在室温下孵育60分钟

8. 分别加入xx微升 酶解液(Reagent F)

9. 轻轻摇动96孔酶标板30秒

10.在室温下孵育30分钟

11.分别加入xx微升 终止液(Reagent G)

12.即刻放进荧光酶标仪检测:获得相对荧光读数RFU(Relative Fluorescence Unit)

13.活性计算:

1) 构建标准曲线:纵座标(Y轴)为相对荧光单位RFU;横座标(X轴)为标准EDAN浓度(微摩尔/升)

2) 根据标准曲线计算样品中所释放的EDAN浓度

3) 实际活性计算:

[样品EDAN浓度(微摩尔/升)X样品稀释倍数]÷ 1(小时;反应时间)]=纳摩尔EDAN/毫升/小时÷(样品蛋白浓度)毫克/毫升=纳摩尔EDAN/毫克/小时

 

(二)活性抑制测定(抑制剂筛选)

1. 在96孔酶标板上做好相应标记:背景、零抑制、完全抑制和待测抑制剂样品

2. 按下表加入试剂

内容物

样本背景

零抑制对照

完全抑制对照

待测抑制活性

 

 

(0%抑制)

100%抑制)

 

缓冲液(Reagent C)

微升

微升

微升

微升

底物液(Reagent D)

――

微升

微升

微升

待测抑制剂

微升

――

――

微升

用户自备的纯化酶

微升

微升

微升

微升

反应液(Reagent E)

微升

微升

――

微升

96孔板每孔总量

背景孔

( 微升)

零抑制孔

( 微升)

完全抑制孔

( 微升)

待测抑制剂样品

( 微升)

 

3. 轻轻摇动96孔酶标板30秒

4. 在室温下孵育60分钟

5. 分别加入xx微升 酶解液(Reagent F)

6. 轻轻摇动96孔酶标板30秒

7. 在室温下孵育30分钟

8. 分别加xx微升 终止液(Reagent G)

9. 即刻放进荧光酶标仪检测:获得相对荧光读数RFU(Relative Fluorescence Unit)

10.抑制活性计算:

1)[(完全抑制读数-零抑制读数)-(抑制剂样品读数-样本背景读数)]÷(完全抑制读数-零抑制读数)=实际抑制百分率

2)IC50:50%抑制率所需的抑制剂浓度

X(所需抑制剂浓度)=(已知抑制剂样品浓度÷实际抑制百分率)X 50%

3)直接构建抑制曲线:纵座标(Y轴)为相对荧光单位RFU;横座标(X轴)为已知抑制剂浓度

 

(三)磷酸化百分率测定

1. 在96孔酶标板上做好相应标记:背景、零磷酸化、完全磷酸化和待测样品

2. 按下表加入试剂

内容物

样本背景

完全磷酸化对照

(100%磷酸化)

零磷酸化对照

(0%磷酸化)

待测样品磷酸化

缓冲液(Reagent C)

微升

微升

微升

微升

底物液(Reagent D)

――

――

微升

微升

样品液

微升

――

――

微升

磷酸化多肽

――

微升

――

――

反应液(Reagent E)

微升

微升

微升

微升

96孔板每孔总量

背景孔

( 微升)

完全磷酸化孔

( 微升)

完全磷酸化孔

( 微升)

完全磷酸化孔

( 微升)

3. 轻轻摇动96孔酶标板30秒 4

4. 在室温下孵育60分钟

5. 分别加入xx微升 酶解液(Reagent F)

6. 轻轻摇动96孔酶标板30秒

7. 在室温下孵育30分钟

8. 分别加入xx微升 终止液(Reagent G)

9. 即刻放进荧光酶标仪检测:获得相对荧光读数RFU(Relative Fluorescence Unit)

10.磷酸化百分率计算:

[(完全磷酸化读数-零磷酸化读数)-(样品读数-样本背景读数)]÷(完全磷酸化读数-零磷酸化读数)=样品磷酸化百分率

 

注意事项

1. 本产品为25次操作,包括标准液

2. 操作时,须戴手套

3. 系统操作过程中,标准液测定只需1次

4. 样品须澄清,至关重要

5. 孵育反应完成后即刻进行荧光测定

6. 荧光滤波器可以使用激发波长在340±30nm,散发波长490±30nm

7. 待测样本为粗提酶样品,其蛋白浓度为20微克/20微升;待测样本为细胞裂解悬液,其蛋白浓度为100微克/20微升

8. 如果待测样品浓度过高或过低,可以调整样品浓度

9. 相对荧光读数RFU(Relative Fluorescence Unit)越高,表明酶活性越低

10.需要 磷酸化底物液(Reagent I),须另外订购

11.可以使用CDK1/CYCLIN B抑制剂(CGP74514A)作为抑制剂对照(IC50=0.025微摩尔)或阴性对照

12.本公司提供系列蛋白激酶检测试剂产品

 

质量标准

1. 本产品经鉴定性能稳定

2. 本产品经鉴定检测敏感