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组织SPHK1激酶活性光谱法定量检测试剂盒

 发布时间:2017-01-18 点击量:1430

组织SPHK1激酶活性光谱法定量检测试剂盒

产品说明书

 

主要用途

 

组织SPHK1激酶活性光谱法定量检测试剂是一种旨在通过底物D-苏式-鞘胺醇C-18SPHK1激酶敏感性抑制剂存在与否的情况下,受到SPHK1磷酸化后,进而由丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶连续循环法反应系统,测定产生ADP过程中,伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的氧化反应, 即采用光谱法测定其氧化后吸光峰值的变化,以分析组织裂解样品中SPHK1活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的其适用于各种组织裂解萃取液样品(动物、人体)、部分或完全纯化酶样品中SPHK1激酶特异活性的定量检测,以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌,即到即用,操作简捷,性能稳定,高度敏感。

 

技术背景

 

鞘胺醇激酶(Sphingosine kinase;SPHK1;EC2.7.11.13),属于脂类激酶(lipid kinase)类,包神经鞘氨醇激酶(ceremide kinase)、二酰甘油激酶(diacylglycerol kinase;DAGK)和磷酸肌醇3激酶(Phosphoinositide 3-kinase;PI3K)等,在原生动物、酵母、植物、哺乳动物等具有进化保留,其中哺乳动物有2个同工酶:SPHK1和SPHK2,SPHK1分子量小,但活性高。SPHK1主要在肺、肝、脾脏等高度表达,而SPHK2主要在肝脏和心脏高度表达。SPHK主要在胞浆里,通过磷酸化鞘胺醇(Sphingosine),产生鞘氨醇-1-磷酸(Sphingosine-1-phosphate;S-1-P),一种具有强力生物活性的鞘脂类分子(sphingolipids),成为细胞繁殖、分化、运动、存活、免疫细胞活化、钙离子信号通路、细胞骨架重构、发育形态变化等重要的调节性信使分子。由此成为抗炎、抗癌和其它病理条件治疗的重要药物靶标。基于底物D-苏式-鞘胺醇C-18(D-erythro-Sphingosine C-18),在SPHK1激酶敏感性抑制剂SKI5C(2,2-dimethyl-4S-(1-oxo-2-hexadecyn-1-yl)-1,1-dimethylethyl ester-3-oxazolidine carboxylic acid)存在与否的情况下,受到SPHK1激酶的磷酸化,获得产物鞘氨醇-1-磷酸(Sphingosine-1-phosphate;S-1-P)和ADP,进而通过丙酮酸激酶(pyruvate kinase;PK)和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase;LDH)反应系统中,还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide;NADH)转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotideNAD),其吸光峰值的变化340nm,来定量分析鞘胺醇激酶1的特异活性其反应方式为:

 

产品内容

 

清理液(Reagent A)

毫升

裂解液(Reagent B)

毫升

缓冲液(Reagent C)

毫升

酶促液(Reagent D)

微升

反应液(Reagent E)

微升

底物液(Reagent F)

微升

阴性液(Reagent G)

微升

专性液(Reagent H)

微升

说明书

1份

 

保存方式

 

保存清理液(Reagent A)4冰箱里;其余的保存在-20冰箱里,严格避免光照和反复冻融;有效保证6

 

用户自备

 

SPHK1激酶:用于抑制剂筛选

1.5毫升离心管:用于样品保存的容器

15毫升锥形离心管:用于样品处理的容器

(微型)台式离心机:用于样品预处理

比色皿或96孔板:用于光谱分析操作的容器

分光光度仪或酶标仪:用于样品光谱分析

 

实验步骤

 

  • 待测样品准备

 

  • 手术取出动物组织,并秤重500毫克组织重量 
  • (选择步骤)放进预冷的15毫升锥形离心管
  • (选择步骤)加入xx毫升清理液(Reagent A清洗
  • (选择步骤)抽去清理液
  • 移入到一个液氮冻存管
  • 即刻放进液氮罐过一夜
  • 次日从液氮罐里取出,即刻(快速度)用研磨棒碾碎组织成粉末状(注意:切莫使组织冻融)
  • 放进一个15毫升锥形离心管
  • 加入置于冰槽里的xx微升裂解液(Reagent B 
  • 强力涡旋震荡30秒,充分混匀
  • 放进冰槽里孵育30分钟,期间每10分钟强力涡旋震荡30(注意:如需暂时停止,放进-70℃冰箱里储存备用)
  • 即刻放进4℃台式离心机离心10分钟,速度为10000g
  • 小心移取上清液到新的无菌的1.5毫升离心管
  • 移取10微升进行蛋白定量检测
  • 放进-70的冰箱里保存或置于冰槽里备用

 

  • 测定准备

 

  • 准备好待测样品(例如组织裂解悬液等),置于冰槽里 
  • 设定好分光光度仪(温度为30℃):波长为340nm,间隔1分钟,读数6次(共5分钟),并置零
  • 缓冲液(Reagent C室温下均衡温度

 

  • 背景对照测定

 

  • 移取xx微升缓冲液(Reagent C到新的比色皿
  • 加入xx微升酶促液(Reagent D
  • 加入xx微升反应液(Reagent E
  • 加入xx微升底物液(Reagent F
  • 放进30培养箱里静置3分钟
  • 加入xx微升阴性液(Reagent G
  • 上下倾倒数次,混匀(限定在3秒之内)
  • 即刻放进分光光度仪检测,此为背景空对照:340波长读数0分钟 340波长读数5分钟 

 

  • 样品总活性测定

 

  • 移取xx微升缓冲液(Reagent C到新的比色皿
  • 加入xx微升酶促液(Reagent D
  • 加入xx微升反应液(Reagent E
  • 加入xx微升底物液(Reagent F
  • 放进30培养箱里静置3分钟
  • 加入5微升待测样品(注意:50微克组织裂解蛋白;样品须溶解)
  • 上下倾倒数次,混匀(限定在3秒之内)
  • 即刻放进分光光度仪检测,此为样品总活性读数:340波长读数0分钟 340波长读数5分钟 

 

  • 样品非特异活性测定

 

检测开始前,移取xx微升缓冲液(Reagent C到1.5毫升离心管,分别加入xx微升专性液(Reagent H)待测样品(注意:50微克组织裂解蛋白),混匀后,放进30培养箱里孵育30分钟。然后继续下列操作。

 

  • 移取xx微升缓冲液(Reagent C到新的比色皿
  • 加入xx微升酶促液(Reagent D
  • 加入xx微升反应液(Reagent E
  • 加入xx微升底物液(Reagent F 
  • 放进30培养箱里静置3分钟
  • 加入20微升上述预处理的待测样品
  • 上下倾倒数次,混匀(限定在3秒之内)
  • 即刻放进分光光度仪检测,此为样品非特异活性读数:340波长读数0分钟 340波长读数5分钟
  • 计算样品活性

 

  • 样品总活性和非特异活性计算

 

 

2)样品特异活性计算

 

 

七、酶标仪测定

 

1)样品总活性测定

  • 96孔板上做好相应标记:背景对照和样品
  • 分别移取xx微升缓冲液(Reagent C到96孔板
  • 分别加入xx微升酶促液(Reagent D
  • 分别加入xx微升反应液(Reagent E
  • 分别加入xx微升底物液(Reagent F
  • 轻轻摇动96孔板
  • 30℃温度下孵育3分钟
  • 分别加入xx微升阴性液(Reagent G待测样品(50微克组织裂解悬液蛋白)到相应孔中(注意:样品须清澈
  • 轻轻摇动96孔板
  • 即刻放进酶标仪检测:0分钟读数和5分钟读数
  • 活性计算:

 

 

  • 样品非特异活性测定

 

检测开始前,移取xx微升缓冲液(Reagent C到1.5毫升离心管,分别加入xx微升专性液(Reagent H)待测样品(注意:50微克组织裂解蛋白),混匀后,放进30培养箱里孵育30分钟。然后继续下列操作。

 

  • 96孔板上做好相应标记:待测样品
  • 移取xx微升缓冲液(Reagent C到96孔板
  • 加入xx微升酶促液(Reagent D
  • 加入xx微升反应液(Reagent E
  • 加入xx微升底物液(Reagent F 
  • 轻轻摇动96孔板
  • 30℃温度下孵育3分钟
  • 加入20微升上述预处理的待测样品
  • 轻轻摇动96孔板
  • 即刻放进酶标仪检测:0分钟读数和5分钟读数
  • 活性计算:

 

 

  • 样品特异活性计算

 

 

八、抑制剂筛选

 

  • 96孔板上做好相应标记:背景、完全活性和待测抑制剂样品
  • 按下表加入试剂,进行样品预处理

 

内容物

空背景对照

样本背景

完全酶活性

待测抑制剂酶活性

缓冲液(Reagent C

xx微升

xx微升

xx微升

xx微升

阴性液(Reagent G)

xx微升

xx微升

xx微升

——

待测抑制剂

——

xx微升

――

xx微升

用户自备的纯化酶

——

——

xx微升(1毫单位)

xx微升(1毫单位)

96孔板每孔总量

空背景对照

xx微升)

样本背景孔

xx微升)

完全活性

xx微升)

待测抑制剂样品

xx微升)

轻轻摇动96孔板,混匀放进30培养箱里孵育30分钟。然后进行下列操作

 

  • 分别移取xx微升缓冲液(Reagent C新的96孔板的所有
  • 分别加入xx微升酶促液(Reagent D
  • 分别加入xx微升反应液(Reagent E
  • 分别加入xx微升底物液(Reagent F 
  • 轻轻摇动96孔板
  • 在30温度下孵育3分钟
  • 加入20微升上述预处理的待测样品
  • 即刻放进30酶标仪检测:测读30分钟
  • 抑制活性计算:

 

注意事项

 

  • 本产品为20次操作
  • 操作时,须戴手套
  • 系统操作过程中,背景测定只需1
  • 样品处理忌用磷酸缓冲溶液
  • 样品须澄清,至关重要 
  • 如果出现明显的干扰现象,建议使用样本背景对照去除任何内源性干扰因子
  • 加入样品启动反应后3秒内即刻光谱测定
  • 测定值由高到低变化;测定可持续30分钟
  • 光谱测定后,比色皿须清洗彻底
  • 样本测定0分钟读数高于5分钟读数表明具有酶活性
  • 建议待测样本蛋白浓度为50微克/5微升
  • 如果待测样品浓度过高或过低,可以调整样品浓度
  • 可以使用SPHK1抑制剂作为抑制剂对照或阴性对照
  • 鞘胺醇激酶1活性单位浓度定义:在30温度下,pH 7.5条件下,每分钟内能够氧化1微摩尔还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH所需的酶量作为一个活性单位
  • 本公司提供系列蛋白激酶检测试剂产品

 

质量标准

 

  • 本产品经鉴定性能稳定
  • 本产品经鉴定检测敏感