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组织血管紧张素Ⅰ转化酶总活性比色法定量检测试剂盒

 发布时间:2017-01-18 点击量:320

组织血管紧张素Ⅰ转化酶总活性比色法定量检测试剂盒
说明书
主要用途
组织血管紧张素Ⅰ转化酶(ACE)总活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过三肽化合物底
物FAPGG 受到血管紧张素Ⅰ转化酶的水解,释放出FAP,产生吸收峰值的变化,即采用比
色法来测定组织裂解萃取样品中酶活性的而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精
心研制、成功实验证明的。其适用于各种组织裂解萃取液样品(动物、人体、植物、昆虫等)
血管紧张素Ⅰ转化酶(ACE)的总活性检测,以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌,
即到即用,操作简捷,性能稳定,具有高通量、自动化操作的优点。
技术背景
血管紧张素Ⅰ转化酶(angiotensin I-converting enzyme;ACE;EC3.4.15.1),又称为肽基二
肽酶A(peptidyl dipeptidase A)、羧基组织蛋白酶(carboxycathepsin)或激肽酶II(kininase
II),是一种体细胞类150 至180KD、生殖细胞类90 至110KD 的多肽外切酶(exopeptidase)
和锌金属肽酶(zinc metallopeptidase)。血管紧张素Ⅰ转化酶有2 种同工酶:1 型和2 型,其
间80 至90%同源。I 型主要存在于肺毛细管细胞内,也在血管内皮细胞、肾上皮细胞和睾
丸leydig 细胞膜中表达;II 型主要存在于心脏和肾脏血管内皮细胞膜上。ACE 在肾素-血管
紧张素-醛固酮(aldosterone)系统中发挥重要作用。作为血管收缩剂(vasoconstrictor),ACE
催化十肽血管紧张素I 的C 末端的组胺酰亮氨酸(histidylleucine)二肽的切离水解反应,转
化为血管紧张素II;同时作为血管扩张剂(vasodilator),ACE 使缓激肽(bradykinin)失活。
ACE 常用于药物靶标,治疗高血压(例如噻嗪化物thiazide)、心力衰竭(例如利尿灵
furosemide)、糖尿病肾有关病和SARS 等疾患。基于人工合成的三肽化合物底物呋喃基丙烯酰苯
丙氨酰甘氨酰甘氨酸(N-[3-(2-furyl)acryloyl]-L-phenylalanylglycylglycine;FAPGG)受到血
管紧张素Ⅰ转化酶的水解,释放出呋喃基丙烯酰苯丙氨酸(furylacryloylphenylalanine;FAP)
和双甘氨肽(glycylglycine),产生吸收峰值的变化,在分光光度仪(340nm 波长)下,来
定量测定血管紧张素Ⅰ转化酶的总活性。血管紧张素Ⅰ转化酶反应系统为:
产品内容
清理液(Reagent A) 毫升
裂解液(Reagent B) 毫升
缓冲液(Reagent C) 毫升
阴性液(Reagent D) 毫升
底物液(Reagent E) 毫升
说明书1 份
保存方式
保存清理液(Reagent A)在4℃冰箱里;其余的保存在-20℃冰箱里;底物液(Reagent E)
避免光照和反复冻融;有效保证6 月
用户自备
15 毫升锥形离心管:用于样品制备的容器
1.5 毫升离心管:用于样品制备和储存的容器
超速离心管:用于样品离心的容器
台式离心机:用于样品沉淀
4℃超速离心机:用于分离膜蛋白成分
DOUNCE 匀浆器:用于裂解组织细胞
培养箱:用于反应物孵育
酶标板或比色皿:用于样品比色测定的容器
酶标仪或分光光度仪:用于样品比色分析
实验步骤
一、样品制备
1. 手术取出动物组织,并秤重以确定500 毫克组织重量
2. (选择步骤)放进预冷的15 毫升锥形离心管
3. (选择步骤)加入毫升清理液(Reagent A)清洗1 次
4. 移入到一个液氮冻存管
5. 即刻放进液氮罐过一夜
6. 次日从液氮罐里取出,即刻(快速度)用研磨棒碾碎组织成粉末状(注意:切莫使组
织冻融)
7. 放进一个15 毫升锥形离心管
8. 加入预冷的微升裂解液(Reagent B)
9. 涡旋震荡5 秒,充分混匀
10. 即刻放入预冷的DOUNCE 匀浆器
11. 在冰槽里用研磨棒匀化组织(约80 下)
12. 将所有组织匀浆物移入15 毫升锥形离心管
13. 放进4℃台式离心机离心10 分钟,速度为1500g
14. 小心移出上清液到另一个新的预冷的超速离心管
15. 加入微升裂解液(Reagent B),混匀沉淀颗粒——此步骤获得粗提总蛋白
16. (选择步骤)放进上述超速离心管到4℃超速离心机离心30 分钟,速度为40000g
17. (选择步骤)小心移出上清液到到预冷的1.5 毫升离心管——此步骤获得膜蛋白
18. 移取10 微升进行蛋白定量检测
19. 即刻放进-70℃保存或置于冰槽里继续后续操作
二、测定准备
1. 准备好药物处理的待测样品
2. 设定好酶标仪(温度为37℃):波长340nm,间隔5 分钟,读数6 次(共30 分钟),并
置零或0 分钟和30 分钟各测读1 次,并置零
3. 实验开始前,将-20℃冰箱里的试剂盒中的底物液(Reagent E)置入冰槽里融化,避
免光照
三、活性测定
1. 在96 孔酶标板上做好相应标记:背景对照和样品
2. 分别移取微升缓冲液(Reagent C)到相应孔中
3. 分别加入20 微升阴性液(Reagent D)或上述制备的待测样品(100 微克蛋白)到相应
孔中(注意:样品须清澈)
4. 分别加入微升底物液(Reagent E)
5. 轻轻摇动96 孔酶标板(限定在10 秒之内)
6. 即刻放进37℃预热的酶标仪检测或转移到200 微升比色皿,在分光光度仪里检测
7. 获得吸光读数:0 分钟读数-30 分钟读数
8. 活性计算:
(1) 酶标仪检测
单位=微摩尔FAP/分钟
(2) 比色皿检测
单位=微摩尔FAP/分钟
注意事项
1. 本产品为20 次操作,包括背景对照
2. 操作时,须戴手套
3. 系统操作过程中,背景测定只需1 次
4. 样品须澄清,且避免反复冻融
5. 样品避免使用EDTA 和EGTA 等处理
6. 加样后10 秒内比色测定
7. 测定值由高到低变化;测定持续30 分钟
8. 比色测定后,比色皿须清洗彻底
9. 样品0 分钟读数通常和背景空对照0 分钟读数一致
10.样本测定30 分钟读数低于0 分钟读数,即读数下降,表明具有酶活性
11.建议待测样本蛋白浓度为100 微克/20 微升;如果样本酶活性过低或过高,则可以增加
或降低样本量(我司提供Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒)
12.如果待测样品浓度过高或过低,可以调整样品浓度
13.可以使用血管紧张素Ⅰ转化酶抑制剂卡托普利(captopril;IC50=10 纳摩尔)作为抑制
剂对照或阴性对照
14.血管紧张素Ⅰ转化酶单位活性定义为:在37℃,pH 8.3 条件下,每分钟内能够产生1
微摩尔呋喃基丙烯酰苯丙氨酸(Furylacryloylphenylalanine)所需的酶量作为一个活性单位
15.本公司提供系列血管紧张素Ⅰ转化酶学检测试剂产品
质量标准
1. 本产品经鉴定性能稳定
2. 本产品经鉴定检测敏感