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动物细胞钠/钾ATP检测试剂盒

 发布时间:2017-01-18 点击量:349

动物细胞钠/钾ATP检测试剂盒

产品说明书
主要用途
动物细胞钠/钾ATP酶(Na+/K+ -ATPase)活性酶连续反应光谱法定量检测试剂是一种旨在使用钠/钾ATP酶、丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶连续循环法反应系统,在特异性抑制剂存在与否的情况下,受到钠钾ATP酶的水解产生的ADP过程中,伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的氧化反应, 即采用光谱法测定其氧化后吸光峰值(NADH浓度)的变化,以此进行测算单位酶活性的而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。其适合于各种动物细胞裂解悬液Na+/K+-ATP酶的特异性活性检测。产品不含污染性蛋白酶,严格无菌,即到即用,操作简捷,性能稳定,反应优化,检测敏感。
技术背景
钠/钾ATP酶(Na+/K+-ATPase;EC3.6.1.3),是五类ATP酶(F、V、A、P和E型)中P型ATP酶(P type ATPase)之一。ATP酶催化三磷酸腺苷分解为二磷酸腺苷和无机磷。这一去磷酸化反应释放出能量,成为细胞生命代谢的能源。ATP酶为跨膜蛋白(transmembrane),帮助传输各种代谢分子进出细胞。P型ATP酶,又称为E1-E2 ATP酶,通常由一条或两条多肽构成,且呈现两种主要的结构构象E1和E2。这类ATP酶存在于细菌和真核细胞膜和细胞器上,其功能在于水解ATP获得能量,跨膜运输各种化学分子,包括离子和磷脂,例如H+、Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Ag+、Zn2+、Co2+、Pb2+、Ni2+、Cd2+、Cu2+等。P型ATP酶可以分成4种,Ca2+传输性、Na+-K+ /H+-K+传输性、H+传输性和所有细菌型等。钠/钾ATP酶,又称为钠钾泵(Na+-K+ pump),是一种电致(electrogenic)膜蛋白。细胞排钠吸钾时,细胞膜两边无电荷流动,并建立细胞内外离子(胞内低钠、胞外高钾)浓度平衡,维持细胞静态膜电位,控制细胞容量。钠/钾ATP酶是心脏病的重要药物靶标。基于ATP,在钠/钾ATP酶抑制剂乌本苷(ouabain)存在与否的情况下,受到钠钾ATP酶的水解,进而通过丙酮酸激酶(pyruvate kinase;PK)和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase;LDH)反应系统中,还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide;NADH)转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide;NAD),其吸光峰值的变化(340nm),来定量分析钠/钾ATP酶的特异活性。其反应系统为:
Na+/K+-ATPase
ATP + H2O → ADP + Pi
ouabain
pyruvate kinase
Phosphoenolpyruvate + ADP → pyruvate + ATP
lactate dehydrogenase
pyruvate + NADH → lactate + NAD+
(高吸收峰) (低吸收峰)
产品内容 1
酶 活性酶连续反应光谱法定量
清理液(Reagent A) 毫升
裂解液(Reagent B) 毫升
缓冲液(Reagent C) 毫升
酶促液(Reagent D) 微升
反应液(Reagent E) 毫升
底物液(Reagent F) 毫升
阴性液(Reagent G) 毫升
专性液(Reagent H) 毫升
产品说明书 1份
保存方式
保存在-20℃冰箱里,避免反复冻融;底物液(Reagent F),避免光照,有效保证6月
用户自备
15毫升锥形离心管:用于样品操作的容器
1.5毫升离心管:用于样品操作和保存的容器
细胞刮脱棒:用于细胞脱离
(微型)台式离心机:用于样品操作
培养箱:用于反应孵育
比色皿:用于光谱分析的容器
分光光度仪:用于光谱分析
实验步骤
实验开始前,将-20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液置入冰槽里融化;缓冲液(Reagent C)室温预热;底物液(Reagent F)注意避光。然后进行下列操作。
一、 样品准备(总蛋白制备)
1. 准备好25cm2细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞(1至5 X 106细胞)
2. 小心加入xx毫升清理液(Reagent A),覆盖生长表面
3. 小心抽去清理液
4. 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞
5. 加入xx毫升清理液(Reagent A),混匀细胞
6. 移入到预冷的15毫升锥形离心管(注意:悬浮细胞从这一步骤开始)
7. 放进4℃台式离心机离心5分钟,速度为300g
8. 小心抽去上清液
9. 加入xx微升裂解液(Reagent B),充分混匀
10.转移到预冷的1.5毫升离心管
11.强力涡旋震荡15秒
12.置于冰槽里孵育30分钟 2
13.放进4℃微型台式离心机离心5分钟,速度为16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415)
14.小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
15.移取10
16.即刻放进-70℃保存或置于冰槽里继续后续操作
二、测定准备
1. 准备好待测样品(例如细胞总蛋白或膜蛋白等),置于冰槽里
2. 设定好分光光度仪(温度为37℃):波长为340nm,间隔5分钟,读数7次(共30分钟),并置零
三、 背景对照测定
1. 移取xx微升缓冲液(Reagent C)到新的比色皿
2. 加入xx微升酶促液(Reagent D)
3. 加入xx微升反应液(Reagent E)
4. 加入xx微升底物液(Reagent F)
5. 放进37℃培养箱里静置3分钟
6. 加入xx微升阴性液(Reagent G)
7. 上下倾倒数次,混匀(限定在3秒之内)
8. 即刻放进分光光度仪检测,此为背景空对照:340波长读数0分钟 -340波长读数30分钟
四、 样品总活性测定
1. 移取xx微升缓冲液(Reagent C)到新的比色皿
2. 加入xx微升酶促液(Reagent D)
3. 加入xx微升反应液(Reagent E)
4. 加入xx微升底物液(Reagent F)
5. 放进37℃培养箱里静置3分钟
6. 加入50微升待测样品(注意:50微克膜蛋白;样品须溶解)
7. 上下倾倒数次,混匀(限定在3秒之内)
8. 即刻放进分光光度仪检测,此为样品总活性读数:340波长读数0分钟 -340波长读数30分钟
五、样品非特异活性测定
1. 移取xx微升缓冲液(Reagent C)到新的比色皿
2. 加入xx微升酶促液(Reagent D)
3. 加入xx微升专性液(Reagent H)
4. 加入xx微升底物液(Reagent F)
5. 放进37℃培养箱里静置3分钟
6. 加入50微升待测样品(注意:50微克膜蛋白;样品须溶解)
7. 上下倾倒数次,混匀(限定在3秒之内)
8. 即刻放进分光光度仪检测,此为样品非特异活性读数:340波长读数0分钟 -340波长读数30分钟
六、 计算样品活性 3
微升进行蛋白定量检测
1)样品活性(总活性和非特异活性)
[(样品读数-背景读数)X 1(体系容量;毫升)X样品稀释倍数]÷[0.05(样品容量;毫升)X 6.22(毫摩尔吸光系数)X 10或30(反应时间,分钟)]=单位/毫升÷(样品蛋白浓度)毫克/毫升=单位/毫克
或者
[(样品读数-背景读数)X 1(体系容量;毫升)X样品稀释倍数]÷[0.05(样品重量;毫克)X 6.22(毫摩尔吸光系数)X 10或 30(反应时间,分钟)]=单位/毫克
单位=微摩尔NADH/分钟
2)样品特异活性
样品总活性测定-样品非特异活性测定=样品特异活性
注意事项
1. 本产品为21次操作(10个样本),包括背景对照测定
2. 操作时,须戴手套
3. 系统操作过程中,背景测定只需1次
4. 建议样品忌用磷酸缓冲溶液、钙盐、镁盐等,可以使用SUCROSE、IMIDAZOLE等
5. 建议使用细胞膜蛋白(本公司提供细胞可溶性膜蛋白(粗提)制备试剂盒)
6. 加入样品启动反应后3秒内即刻光谱测定
7. 如果测定初期,背景对照吸光读数不稳定,表明体系均衡温度不理想,建议样品加入前孵育由3分钟延长至5分钟
8. 反应测定值由高到低变化;测定可以持续30分钟
9. 测定值由高到低变化,即0分钟测定读数高于10分钟或30分钟测定读数,表明有酶活性
10.光谱测定后,比色皿须清洗彻底
11.建议待测样本膜蛋白浓度为50微克/50微升;如果样本酶活性过低或过高,则可以增加或降低样本量;注意计算公式的调整(本公司提供 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒)
12.样品特异活性是指乌本苷敏感的钠/钾ATP酶
13.钠/钾ATP酶活性单位浓度定义:在37℃温度下,pH 7.5条件下,每分钟内能够氧化1微摩尔还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)所需的酶量作为一个活性单位
14.本公司提供系列ATP酶类分析技术产品
质量标准
1. 本产品经鉴定性能稳定
2. 本产品经鉴定检测准确
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