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细菌总ATP酶活性酶连续反应比色法定量检测试剂盒

 发布时间:2017-01-18 点击量:1378

细菌总ATP酶活性酶连续反应比色法定量检测试剂盒

产品说明书

 

主要用途

细菌总ATP酶活性酶连续反应比色法定量检测试剂是一种旨在使用ATP酶、丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶连续循环法反应系统,测定ATP水解产生的ADP过程中,伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的氧化反应, 即采用比色法测定其氧化后峰值(NADH浓度)的变化,以此进行测算单位酶活性的而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。其适合于各种细菌细胞ATP酶的总活性检测。产品不含污染性蛋白酶,严格无菌,即到即用,操作简捷,性能稳定,反应优化,检测敏感。

 

技术背景

腺苷三磷酸酶,又称为ATP酶(adenosine triphosphatase;ATPase或ATP phosphohydrolase;EC3.6.1.3),属于磷酸水解酶,可以催化含磷的酸酐分解,即催化三磷酸腺苷分解为二磷酸腺苷和无机磷。ATP酶的去磷酸化反应释放出能量,成为细胞生命代谢的能源。ATP酶为跨膜蛋白(transmembrane),帮助传输各种代谢分子进出细胞。根据ATP酶的结构和功能,分为五类不同的ATP酶,即F、V、A、P和E型。F型,又称为F1F0型,主要在线粒体、叶绿体或细菌细胞膜上,进行氧化磷酸化或光合作用;P型,又称为E1E2 型,存在于细菌和真核细胞膜和细胞器上,其功能在于水解ATP获得能量,跨膜运输各种化学分子,包括Ca2+传输性、Na+-K+ /H+-K+传输性、H+传输性和所有细菌型等。V型,又称为V1V0型,主要存在于真核细胞的液泡(vacuole)中。A型,又称为A1A0型,存在于古生菌(archaea)中。E型,为细胞表面的酶。基于底物ATP, 受到各种组织细胞中的 ATP酶的水解,进而通过丙酮酸激酶(pyruvate kinase;PK)和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase;LDH)反应系统中,由还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide;NADH)转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide;NAD),所产生的峰值变化(340nm),来定量分析ATP酶的总活性。其反应系统为:

 

产品内容

 

裂解液(Reagent A)

毫升

活性液(Reagent B)

微升

缓冲液(Reagent C)

毫升

酶促液(Reagent D)

微升

反应液(Reagent E)

毫升

底物液(Reagent F)

毫升

阴性液(Reagent G)

毫升

说明书

1份

 

保存方式

保存在-20℃冰箱里,避免反复冻融;底物液(Reagent F),避免光照,有效保证6月

 

用户自备

15 毫升锥形离心管:用于样品操作的容器

1.5 毫升离心管:用于样品操作和保存的容器

(微型)台式离心机:用于样品操作

恒温摇床:用于细菌培养

培养箱:用于反应孵育

比色皿:用于比色的容器

分光光度仪:用于比色分析

 

实验步骤

实验开始前,将-20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液置入冰槽里融化; 底物液(Reagent F)注意避光。然后进行下列操作。

 

一、 样品准备

1. 准备好10 毫升待测的细菌放进37℃摇床孵育16 小时,速度为220RPM

2. 直至OD600=0.4 至0.8,即1 至2 X 107细胞/毫升

3. 置于冰槽里5 分钟

4. 放进4℃台式离心机离心5 分钟,速度为1000g

5. 小心抽去上清液

6. 加入 微升裂解液(Reagent A),充分混匀

7. 转移到预冷的1.5 毫升离心管

8. 加入 微升活性液(Reagent B)

9. 强力涡旋震荡15 秒

10.置于冰槽里15 分钟

11.放进4℃微型台式离心机离心15 分钟,速度为16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415)

12.小心移取500 微升上清液到新的预冷的1.5 毫升离心管

13.移取10 微升进行蛋白定量检测(注意:建议使用)

14.即刻放进-70℃保存 或置于冰槽里继续后续操作

 

二、测定准备

1.准备好上述待测样品,置于冰槽里

2.设定好分光光度仪(温度为37℃):波长为340nm,间隔5 分钟,读数5 次(共20 分钟),并置零

 

三、 背景对照测定

1.移取 微升缓冲液(Reagent C)到新的比色皿

2. 加入 微升酶促液(Reagent D)

3. 加入 微升阴性液(Reagent G)

4. 放进37℃培养箱里静置2分钟

5. (选择步骤)放进分光光度仪,置零

6. (选择步骤)取出比色皿

7. 加入 微升反应液(Reagent E)

8. 加入 微升底物液(Reagent F)

9. 上下倾倒数次,混匀(限定在3秒之内)

10.即刻放进分光光度仪检测,此为背景空对照:340波长读数0分钟 -340波长读数20分钟

 

四、 样品活性测定

1. 移取 微升缓冲液(Reagent C)到新的比色皿

2. 加入 微升酶促液(Reagent D)

3. 加入50微升待测样品(注意:100微克总蛋白;样品须溶解)

4. 放进37℃培养箱里静置2分钟

5. (选择步骤)放进分光光度仪,置零

6. (选择步骤)取出比色皿

7. 加入 微升反应液(Reagent E)

8. 加入 微升底物液(Reagent F)

9. 上下倾倒数次,混匀(限定在3秒之内)

10.即刻放进分光光度仪检测,此为样品总活性读数:340波长读数0分钟 -340波长读数20分钟

 

五、 计算样品活性

或者

单位=微摩尔NADH/分钟

 

注意事项

1. 本产品为20次操作,包括背景对照

2. 操作时,须戴手套

3. 系统操作过程中,背景测定只需1次

4. 建议样品忌用磷酸缓冲溶液

5. 如果使用细菌膜性囊泡样品,建议使用本公司提供的细菌膜性囊泡(RSOV和IOV)制备

6. 加入底物液(Reagent F)后3秒内即刻比色测定

7. 反应测定值由高到低变化;测定可以持续20分钟

8. 测定值由高到低变化,即0分钟测定读数高于10分钟或20分钟测定读数,表明有酶活性 试剂盒

9. 比色测定后,比色皿须清洗彻底

10.建议待测样本蛋白浓度为100微克/50微升;如果样本酶活性过低或过高,则可以增加或降低样本量;注意计算公式的调整(本公司提供 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒)

11.ATP酶活性单位浓度定义:在37℃温度下,pH 7.5条件下,每分钟内能够氧化1微摩尔还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)所需的酶量作为一个活性单位

12.本公司提供系列ATP酶类技术产品

 

质量标准

1. 本产品经鉴定性能稳定

2. 本产品经鉴定检测准确