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ATP 生物发光法细胞繁殖与毒性定量检测试剂盒产品说明书

 发布时间:2017-04-05 点击量:387

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ATP 生物发光法细胞繁殖与毒性定量检测试剂盒产品说明书
主要用途
ATP 生物发光法细胞繁殖与毒性定量检测试剂是一种旨在通过萤火虫荧光素酶反应系统,荧光素在酶的催
化下,与ATP 发生反应,产生生物光能,采用冷光仪测定其相对冷光单位的变化,来评价细胞生长状况的
而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种动物培养细胞应对药物、
毒物、生物因子等外源刺激后的繁殖能力、生长抑制和死亡等检测。产品严格无菌,即到即用,操作简捷,
性能稳定,高度敏感。
技术背景
三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate;ATP)存在于所有代谢活跃的细胞内,是细胞活力的标志。一旦细胞
凋亡或坏死,ATP浓度急遽下降。萤火虫荧光素酶(Firefly luciferase)是62 kd 的单体蛋白,催化ATP依赖
性荧光素(luciferin)的氧化,经过电子转移,将化学能转化为氧化型荧光素(oxyluciferin)的光能,与ATP
量成线性正相关,通过冷光仪(560nm)检测,由此评价细胞活力。其反应方式为:
luciferase
ATP + D-Luciferin + O2 → Oxyluciferin + AMP + PPi + CO2 + Light
Mg2+
产品内容
裂解液(Reagent A) 2.5 毫升
反应液(Reagent B) 2.5 毫升
产品说明书1 份
保存方式
保存在-20℃冰箱里,严格避免光照和反复冻融,有效保证6 月
用户自备
黑色96 孔板:用于冷光检测操作的容器
平式摇荡仪:用于混匀孵育反应
孔板离心机:用于澄清反应液
冷光仪:用于样品冷光检测
实验步骤
实验开始前,从-20℃冰箱里取出试剂,置于室温下预热15 分钟,避免光照;设置好冷光仪:温度22℃,
1 秒延时(Delay),1 秒整合(Integration)检测。同时关上操作室的灯光。然后进行下列操作。
1. 准备黑色96 孔细胞培养板的待测细胞(每孔100 微升):包括无细胞的培养液(背景空对照孔),未处
理的对照细胞(样品对照孔),以及药物处理的细胞(处理样品孔),并做好标记(细胞密度为每孔1 X
103 至1 X 104 细胞)
2. 到规定的检测时间点,从湿润的细胞培养箱里取出待测的96 孔细胞培养板(注意:确保细胞培养液维
持在100 微升容量)
3. 室温下静置5 分钟
4. 分别加入50 微升裂解液(Reagent A)
5. 室温下(22℃),置于平式摇荡仪孵育10 分钟,速度为50 RPM
6. 分别加入50 微升反应液(Reagent B)
7. 室温下(22℃)孵育1 分钟,速度为50 RPM,避免光照
8. (选择步骤)放进孔板离心机离心5 分钟,速度为250g
9. (选择步骤)分别移取100 微升上清液转移到新的黑色96 孔板里或使用冷光仪测试杯
10.即刻放进冷光仪检测:1 秒延时,1 秒检测
11.绘制细胞生长曲线:纵座标(Y 轴)为相对发光单位(RLU);横坐标(X 轴)为细胞数或时间点或药
物浓度
12.计算细胞活力(%)
【(处理样品孔RLU-背景空对照孔RLU)÷(样品对照孔RLU-背景空对照孔RLU)】X 100%
注意事项
1. 本产品为50 次操作
2. 所有操作均须无菌状态下进行
3. 操作时,须戴手套
4. 建议每个样品安排3 个孔,即重复3 次,计算时取其平均值
5. 每孔中的培养液需100 微升,避免使用周边培养孔(常常液体蒸发而减少)
6. 反应液(Reagent B)具有光高度敏感性,因此整个操作须避光进行,避免反复冻融
7. 由于ATP 无处不在,且热稳定性。建议使用的枪头、用具须严格无菌,避免重复使用;操作时避免污
染试剂溶液,不得用手触摸试剂容器的内盖
8. 高于10%血清浓度会干扰检测
9. 如果用户没有冷光仪,可以使用闪烁探测器(scitillation counter 或β计数器)替代,但敏感性较低
10.如果样品ATP 浓度较低,可以整合检测至10 秒
11.如果是注射式冷光仪,建议测试前后使用无离子水冲洗冷光仪注射(injector)管道
12.本公司提供系列ATP 和细胞繁殖检测试剂产品
质量标准
1. 本产品经鉴定性能稳定
2. 本产品经鉴定检测敏感