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ELISA试剂盒实验原理、步骤以及问题分析

 发布时间:2018-03-09 点击量:467

ELISA试剂盒实验原理

酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)原理

1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent 

assay,ELISA)用于IgG定量测定的文章,使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成

液体标本中微量物质的测定方法。

ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗

体仍保持其免疫学活性,酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性,又保留酶的活性。在测定

时,受检标本(测定其中的抗体或抗原)与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使

固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体,也

通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入

酶反应的底物后,底物被酶催化成为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,故

可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。

由于酶的催化频率很高,故可极大地地放大反应效果,从而使测定方法达到很高的敏感度


类型及步骤

ELISA的主要常用类型及步骤

1. 间接法测抗体

间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体(二抗)以检测与固相抗原结合的

受检抗体,故称为间接法。操作步骤如下:

1)将特异性抗原与固相载体联结,形成固相抗原,洗涤除去未结合的抗原及杂质。

2)加稀释的样本,保温反应。样本中的特异抗体与固相抗原结合,形成固相抗原抗体复合物。

经洗涤后,固相载体上只留下特异性抗体,样本中的其他成份在洗涤过程中被洗去。

3)加酶标抗抗体。固相免疫复合物中的抗体与酶标抗抗体结合,从而间接地标记上酶。洗涤后

,固相载体上的酶量与样本中受检抗体的量正相关。

4)加底物显色。

2.竞争法测抗原

小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点,因此不能用双抗体夹心法进行测定

,可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标

本中抗原量含量愈多,结合在固相上的酶标抗原愈少,后的显色也愈浅。小分子激素、药物

等ELISA测定多用此法。


如何选择合适的阳性对照?

阳性对照的基本组成应该尽量与检测样本的组成一致,一般阳性对照多以含蛋白保护剂的缓冲

液为基质,加入一定量的待检物质。比如,以人血清为标本的测定,阳性对照多用确定的病人

血清或者以复钙人血浆为原料加入一定量标准品。


如何选择合适的阴性对照?

阴性对照的基本组成也应该尽量与检测样本的组成一致,先行检测确定其中不含待检物质

。比如,检测人血清标本时,阴性对照应该选择正常人血清;检测免疫动物血清中抗体效价时,

阴性对照应该选择该动物的免疫前血清。


如何选择优化的包被条件?

1.包被抗原的选择

包被抗原可分为天然蛋白、重组蛋白和小分子抗原三大类。天然蛋白需经纯化才能用直接吸附

法包被,对于含杂质较多的抗原可以采用间接捕获法包被(先用能够与目的抗原反应的物质如抗

体直接吸附在酶标板上,再通过特异性反应使抗原固相化)。经纯化的重组蛋白一般皆可直接包

板。小分子抗原比如多肽以及一些小分子有机化合物,由于分子量太小,往往难于直接吸附在

酶标板上,一般都先使其与无关蛋白质如BSA等偶联,偶联物吸附于固相载体上。

2.包被液的选择

一般常用的是pH9.6的碳酸盐缓冲液,如果包被的抗原在碱性条件下不稳定的话,也可以使用

pH7.2的磷酸盐缓冲液。

3.包被温度的选择

通常是4-8度条件下过一夜或者37度保温2小时,我们强烈建议4-8度条件下包被,有利于蛋白

活性的保持。

4.包被浓度的选择

包被的适浓度随固相载体和包被物的性质变化,一般蛋白质的包被浓度为1-5ug/ml,要明确

针对特定包被抗原的适包被浓度需要通过实验来确定。

包板后需要封闭吗?应该选择什么样的封闭体系?

封闭是否必要,取决于ELISA的模式及具体的实验条件。一般说来,双抗体夹心法,只要酶标

记物是高活性的,操作时洗涤彻底,不经封闭也可得到满意的结果。而在间接法测定中,封闭

一般是必不可少的。

常用的封闭剂有0.05%-0.5%的BSA、10%的小牛血清、1%明胶、5%的脱脂奶粉,AbMART推荐使

用5%脱脂奶粉,价廉而且封闭能力强,不过5%脱脂奶粉只适合短期内使用,不宜长期保存,所

以试剂盒中较少使用。


如何正确使用酶结合物?

1.酶结合物的稀释液

在稀释液中常加入高浓度的无关蛋白质(例如1%BSA或5%脱脂奶粉),通过竞争抑制酶结合物在

固相载体上的非特异性吸附。一般还加入能够抑制蛋白质吸附于塑料表面的非离子型表面活性

剂,如吐温20(0.05%的浓度较为适宜)。

2.正确稀释酶结合物

酶结合物的合适工作浓度需要通过预实验来确定,浓度过高易导致本底偏高,浓度过低则会导

致阳性信号的减弱。

酶结合物在使用前稀释,稀释后的酶结合物不宜长期保存,因为低浓度的酶结合物极易失

活。


问题/可能的原因/解决方法


1、问题:阴性对照产生了阳性的结果

  可能的原因:试剂或者耗材污染

  解决方法:更换试剂,使用一次性耗材

2、问题:洗板出现问题

  解决方法:更换更强配方的洗涤液,增加洗板次数,延长洗板时间

  (如果是在双抗体夹心法中出现,有可能是包被抗体与二抗间有交叉反应,则要更换包被抗

体或二抗)

3、问题:二抗产生了非特异性吸附

  解决方法:减少二抗使用量,缩短二抗反应时间

4、问题:显色液不新鲜

  解决方法:使用现配的显色液

5、问题:反应信号偏低

  可能的原因:包被条件不合适

  解决方法:提高包板浓度,延长包板时间

6、问题:梯度稀释做ELISA时产生跳孔现象

  可能的原因:酶标板叠放导致传热不均匀,各孔反应温度有差异

  解决方法:尽量避免酶标板叠放在一起

7、问题:移液器稀释时未能保持连续性

  解决方法:定期校准移液器,确保移液器的正确使用