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组织亮氨酸氨基肽酶试剂盒操作说明

 发布时间:2019-10-14 点击量:274

组织亮氨酸氨基肽酶(leucylaminopeptidase活性比色法定量检测试剂盒

产品说明书

 

主要用途

 

组织亮氨酸氨基肽酶(leucylaminopeptidase活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过单肽化合物底物L-Leu-pNA受到亮氨酸氨基肽酶的水解,释放出黄色对硝基苯胺即采用比色法来测定组织裂解萃取样品中酶活性而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的其适用于各种组织裂解萃取液样品(动物、人体、昆虫等)亮氨酸氨基肽酶的活性检测。产品严格无菌,即到即用,操作简捷,性能稳定。

 

技术背景

 

亮氨酸氨基肽酶(leucylaminopeptidase;LAP;EC3.4.1.11,属于金属氨基肽酶(metalloaminopeptidase)家属成员普遍存在于动物、植物、微生物、原虫、寄生虫等,催化蛋白质或多肽分子上N-末端亮氨酸残基的反应,需要二价金属离子,例如镁、锰和锌的参与。其功能在于参与内源性或外源性蛋白质和多肽的分解代谢,蛋白质转换(turnover)和加工(processing),基因表达的调控,抗原加工,植物免疫防御等,以及微生物,包括寄生虫的生命循环(life cycle)的生理活动和致病机制。亮氨酸氨基肽酶抑氨肽酶bestatin和amastatin敏感。并成为疾病治疗的疫苗和药物靶标。基于人工合成的肽化合物底物L-Leu-pNA(L-Leu-p-NitroanilineL-亮氨对硝基苯胺)受到亮氨酸氨基肽酶的水解,释放出黄色硝基苯胺405nm 波长),来定量测定亮氨酸氨基肽酶的活性。亮氨酸氨基肽酶反应系统为:

 

 

产品内容

 

清理液(Reagent A) 毫升

裂解液(Reagent B) 毫升

缓冲液(Reagent C) 毫升

阴性液(Reagent D)   毫升

底物液(Reagent E)   微升

产品说明书    1份

 

保存方式

 

保存清理液(Reagent A)在4冰箱里;其余的保存在-20冰箱里;底物液(Reagent E)避免光照和反复冻融;有效保证6月

 

 

 

用户自备

 

1.5毫升离心管:用于样品操作的容器

15毫升锥形离心管:用于样品操作的容器

微型台式离心机:用于样品沉淀

培养箱:用于反应物孵育

96孔板或100微升1厘米光径比色皿:用于样品比色测定的容器

酶标仪或分光光度仪:用于样品比色分析

 

实验步骤

  

  • 样品制备

 

  • 手术取出动物组织,并秤重以确定500毫克组织重量 
  • (选择步骤)放进预冷的15毫升锥形离心管
  • (选择步骤)加入xx毫升清理液(Reagent A)清洗1次
  • 移入到一个液氮冻存管
  • 即刻放进液氮罐过夜
  • 次日从液氮罐里取出,即刻(快速度)用研磨棒碾碎组织成粉末状(注意:切莫使组织冻融
  • 放进一个15毫升锥形离心管
  • 加入预冷的xx微升裂解液(Reagent B) 
  • 转移到预冷的1.5毫升离心管
  • 强力涡旋震荡30秒,充分混匀
  • 置于冰槽里孵育30分钟,期间每10分钟强力涡旋震荡30秒(注意:如需暂时停止,放进-70冰箱里储存备用
  • 放进4微型台式离心机离心5分钟,速度为16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415)
  • 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
  • 移取10微升进行蛋白定量检测(注意:建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒-30030.1
  • 即刻放进-70保存或置于冰槽里继续后续操作

 

  • 测定准备

 

  • 准备好药物处理的待测样品
  • 设定好酶标仪(温度为25℃):波长405nm
  • 实验开始前,将-20℃冰箱里的试剂盒中的底物液(Reagent E)置入冰槽里融化,避免光照
  • 缓冲液(Reagent C)室温下均衡温度

 

  • 活性测定

 

  • 在96孔板上做好相应标记:背景对照和样品
  • 分别移取xx微升缓冲液(Reagent C)到相应孔
  • 分别加入xx微升阴性液(Reagent D)或上述制备的待测样品(50微克蛋白)到相应孔(注意:样品须清澈
  • 分别加入xx微升底物液(Reagent E)
  • 轻轻摇动96孔板(注意:避免气泡
  • 25℃温度下孵育60分钟(注意:可见反应孔里呈现肉眼可见的黄色
  • 即刻放进酶标仪检测或转移到100微升比色皿,在分光光度仪里检测
  • 活性计算:

 

  • 酶标仪检测

 

  • 比色皿检测

 

 

注意事项

 

  • 本产品为20次操作,包括背景对照
  • 操作时,须戴手套
  • 系统操作过程中,背景测定只需1次
  • 样品须澄清,且避免反复冻融
  • 建议待测样本蛋白浓度为50微克/5微升;如果样本酶活性过低,即60分钟读数过低,则可以延长反应孵育时间至90分钟;其次增加样本量(本公司提供  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒30030.1)
  • 如果待测样品浓度过高或过低,可以调整样品浓度
  • 亮氨酸氨基肽酶单位活性定义为:在25℃,pH 8.0条件下,每分钟内能够切离1微摩尔肽化合物底物L-Leu-pNA所需的酶量作为一个活性单位
  • 本公司提供系列蛋白酶学检测试剂产品