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乳酸脱氢酶试剂盒操作说明书

 发布时间:2020-07-01 点击量:126

 

乳酸脱氢酶(Lactate Dehydrogenase,LDH)试剂盒说明书

微量法

产品内容:

提取液:60mL×1 瓶, 4℃保存;

试剂一:液体5 mL×1 瓶, 4℃保存;

试剂二:粉剂×1 支,-20℃保存,用时加入1.3 mL 双蒸水充分溶解备用,现配现用;

试剂三:液体5 mL×1 瓶,4℃保存;

试剂四:液体20 mL×1 瓶,4℃保存;

产品简介:

LDH(EC 1.1.1.27)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,是糖酵解途径的末端酶,催化

丙酮酸与乳酸之间的可逆反应,伴随着NAD+/NADH 之间互变。

LDH 催化NAD+氧化乳酸生成丙酮酸,丙酮酸进一步与2, 4 - 二硝基苯肼作用生成丙酮酸二硝基苯

腙,在碱性溶液中显棕红色,颜色深浅与丙酮酸浓度成正比。

试验中所需的仪器和试剂:

可见分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、

研钵、冰和蒸馏水。

操作步骤:

一、样品测定的准备:

1. 细菌或培养细胞:收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清,按照细菌或细胞数量(104 个):

提取液体积(mL)为500-1000:1 的比例(建议500 万细菌或细胞加入1mL 提取液),超声波破碎

细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30 次),8000g 4℃离心10min,

取上清,置冰上待测。

2. 组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5-10 的比例(建议称取约0.1g 组织,加入1mL

提取液),进行冰浴匀浆;8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

3. 血清(浆)样品:直接检测。

YY-W-A001

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二、测定操作:

1. 分光光度计预热30min 以上,调节波长至450nm,蒸馏水调零。

2. 样本测定(在EP 管中加入下列试剂)

试剂名称(μL) 测定管对照管

样本10 10

试剂一50 50

试剂二10

蒸馏水10

充分混匀,37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴15min

试剂三50 50

充分混匀,37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴15min

试剂四150 150

充分混匀,室温静置3min,450 nm 下测定吸光度,计算ΔA=A 测定管-A 对照管。每个测定管需要

设一个对照管。

LDH 活力单位计算:

A、用微量石英比色皿测定的计算公式如下:

1. 标准条件下测定的回归曲线,y = 0.725x (x 为标准品浓度,μmol/mL;y 为对吸光度)。

2. 血清(浆)LDH 活力的计算

单位的定义:每mL 血清(浆)每分钟催化产生1nmol 丙酮酸定义为一个酶活力单位。

LDH(U/mL)=ΔA÷0.725÷T×103=92×ΔA

3. 细胞、细菌和组织中LDH 活力的计算

(1) 按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每mg 组织蛋白每分钟催化产生1 nmol 丙酮酸定义为一个酶活力单位。

LDH(U/mg prot)=[ΔA÷0.725×V 1] ÷ (V1×Cpr) ÷T×103 =92×ΔA÷Cpr

需要另外测定,建议使用本公司BCA 蛋白质含量测定试剂盒。

(2) 按样本鲜重计算:

单位的定义:每g 组织每分钟催化产生1nmol 丙酮酸定义为一个酶活力单位。

LDH(U/g 鲜重)=[ΔA÷0.725×V 1] ÷ (W ×V1÷V2) ÷T×103 =92×ΔA÷W

(3) 按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每1 万个细菌或细胞每分钟催化产生1nmol 丙酮酸定义为一个酶活力单位。

LDH(U/104 cell)= [ΔA÷0.725×V 1]÷(500 ×V1÷V2) ÷T×103 =0.184×ΔA÷W

V1:加入反应体系中样本的体积,0.01 mL;V2:加入提取液的体积,1 mL; T:反应时间,15 min;

Cpr:蛋白质浓度,mg/mL;W:样品质量,g; 500:细胞或细菌总数,500 万。103:1μmol/mL=103nmol/mL。

B、用96 孔板测定的计算公式如下:

1、标准条件下测定的回归曲线, y = 0.3625x (x 为标准品浓度,μmol/mL;y 为对吸光度)。

2、血清(浆)LDH 活力的计算

单位的定义:每mL 血清(浆)每分钟催化产生1nmol 丙酮酸定义为一个酶活力单位。

LDH(U/mL)=ΔA÷0.3625÷T×103=184×ΔA

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2、细胞、细菌和组织中LDH 活力的计算

(1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每mg 组织蛋白每分钟催化产生1 nmol 丙酮酸定义为一个酶活力单位。

LDH(U/mg prot)=[ΔA÷0.3625×V 1] ÷ (V1×Cpr) ÷T×103 =184×ΔA÷Cpr

需要另外测定,建议使用本公司BCA 蛋白质含量测定试剂盒。

(2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每g 组织每分钟催化产生1nmol 丙酮酸定义为一个酶活力单位。

LDH(U/g 鲜重)=[ΔA÷0.725×V 1] ÷ (W ×V1÷V2) ÷T×103 =184×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每1 万个细菌或细胞每分钟催化产生1nmol 丙酮酸定义为一个酶活力单位。

LDH(U/104 cell)= [ΔA÷0.3625×V 1]÷(500 ×V1÷V2) ÷T×103 =0.368×ΔA÷W

V1:加入反应体系中样本的体积,0.01 mL;V2:加入提取液的体积,1 mL;T:反应时间,15min;

Cpr:蛋白质浓度,mg/mL;W:样品质量,g; 500:细胞或细菌总数,500 万。103:1μmol/mL=103nmol/mL。