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GV3101 菌株使用说明书

 发布时间:2020-11-11 点击量:117

产品说明

GV3101 菌株为 C58 型背景,核基因中含有筛选标签——利福平抗性基因 rif,为了便于转化操作,此菌

株携带一无自身转运功能的胭脂碱型 Ti 质粒 pMP90 (pTiC58DT-DNA),此质粒含有 vir 基因 (vir 基因是

T-DNA 插入植物基因组必需的元件,pMP90 (pTiC58DT-DNA)质粒自身的 T-DNA 转移功能被破坏,但

可以帮助转入的双元载体 T-DNA 顺利转移)pMP90 (pTiC58DT-DNA)Ti 质粒含有筛选标签:gent

赋予 GV3101 菌株庆大霉素抗性,适用于拟南芥、烟草、玉米、土豆等植物的转基因操作。本公司生产

GV3101 化学转化感受态细胞经特殊工艺制作,pCAMBIA2301 质粒检测转化效率>104 cfu/μg DNA

 

常规操作方法

1. -80℃保存的农杆菌感受态于室温或手心片刻待其部分融化,处于冰水混合状态时插入冰中。

2. 100 μl 感受态加 1 μg(体积不大于 10 μl)质粒 DNA,用手管底混匀,依次于冰上静置 5 分钟、

液氮 5 分钟、37℃水浴 5 分钟、冰浴 5 分钟。

3. 加入 700 μl 无抗生素的 LB YEB 液体培养基,于 28℃振荡培养 2~3 小时。

4. 6000 rpm 离心一分钟收菌,留取 100 μl 左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的 LB YEB

平板上,倒置放于 28℃培养箱培养 2-3

(当平板只含有 50 μg/ml kan 时,28℃培养 48 h 即可;平板中同时加入 50 μg/ml kan20 μg/ml rif 时,

28℃培养 60 h;如果使用的平板含有 50 μg/ml rif 则需要 28℃培养 72-90 h)。

 

注意事项

1. 加入质粒时体积不应大于感受态体积的 1/10;质粒不纯或存在乙醇等有机物污染,转化效率急剧下降;质粒增大一倍,

转化效率下降一个数量级。

2. 混入质粒时应轻柔操作。转化高浓度的质粒可相应减少终用于涂板的菌量。

3. 平板上阳性克隆密度过大时,由于营养不足,阳性克隆生长变慢,菌落变小,为了获得大的菌落,应减少质粒用量。

4. 利福平浓度不应高于 25 μg/ml,过高的利福平浓度不利于农杆菌生长,会降低其生长速度和转化效率。本公司 GV3101

感受态计算转化效率时所用平板只含有 50 μg/ml kan,若所用平板含有 20 μg/ml rif 则转化效率降低到 1/2

5. 培养基中加入利福平的目的是防止杂菌生长、筛选农杆菌;根据所用菌株抗性加入链霉素或庆大霉素可防止 Ti 质粒丢

失,但链霉素不利于农杆菌的转基因操作,所以一般培养农杆菌时不考虑链霉素或庆大霉素,Ti 质粒丢失的概率极低 (

以忽略)