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人胚胎干细胞说明书

 发布时间:2021-09-06 点击量:34

人胚胎干细胞(hESC)说明书 



货号:4018106 

规格:1×106 

储存条件:液氮储存产品简介: 

(hESC)在无饲养层、化学成分明确、并且无动物源成分的人多潜能干细胞培养体系中培养,适合临床级细胞研究和应用。hESC在人多潜能干细胞培养体系中可以长期稳定快速增殖,具有典型的hESC克隆形态,表达多潜能标志物基因,长期维持正常核型,并在体内外具有三胚层分化潜能。 

产品内容: 


组分代码 名称 规格 数量 储存条件 

4018106 人胚胎干细胞(hESC) 1×106 2 支 液氮 

1002008 人多潜能干细胞复苏培养基 10 mL 2 瓶 -20℃ 

试剂准备: 

人多潜能干细胞完全培养基:室温解冻人多潜能干细胞添加剂,吹打混匀,随后将添加剂加入人多潜能干细胞基础培养基形成完全培养基(每0.7mL添加剂与50mL基础

培养基混合)。人多潜能干细胞完全培养基可在2 ~ 8℃稳定储存2周。 

注:人多潜能干细胞添加剂需在室温解冻,可按实际用量对添加剂进行分装,分装后重新置于-80 


~ -20℃保存,避免反复冻融。 


                                     

细胞传代条件: 


当满足以下条件之一时需要进行传代: 


干细胞汇合度达到80%以上; 

干细胞集落过大,中央细胞生长不良; 

干细胞集落边缘有开始分化的迹象。细胞传代比例: 


通常早代次(<10代)的干细胞需要以较低的比例传代,如1:2 ~ 1:4;成功建系的干细胞(10代以上) 可以1:6 ~ 1:10的比例传代,传代的比例由细胞株的生长速率决定。 

比较理想的传代时间间隔是3 ~ 6天一次。 


细胞传代操作流程: 

1.将人多潜能干细胞完全培养基取出并平衡至室温,取出包被好Matrigel的培养皿/瓶,吸去包被液并加入适量人多潜能干细胞完全培养基,置于37℃恒温CO 细胞培养箱中。 

2.吸走待传代细胞培养皿/瓶中的人多潜能干细胞完全培养基,并且加入无钙镁的PBS溶液洗一次。 

3.加入人多潜能干细胞消化液使之完全覆盖皿/瓶底。 


4.37℃恒温CO2细胞培养箱中孵育4 ~ 6分钟,显微镜下观察到大部分克隆边缘开始脱离皿/瓶底,克隆内


部大部分细胞间出现较为明显的间隙,肉眼观察到细胞集落变得不透明且发白,表明细胞消化时间理想。 

5.吸去消化液,即刻加入新鲜的人多潜能干细胞完全培养基,用移液器扇形吹打培养皿/瓶底, 使皿/瓶底贴附的干细胞集落脱落,轻柔缓慢吹吸混匀。 

注:吹吸的力度要轻柔,吹打脱落和吹吸混匀的次数总共不超过10次为宜。吹打过度导致大量单细胞出现是造成细胞分化或死亡的重要原因。 

注:如有少量细胞无法从皿底脱落,属于正常现象。如有大量细胞无法从皿底脱落,需延长消化时间。 


6.显微镜下观察细胞呈4 ~ 20个细胞大小的团块,水平十字摇匀。于室温放置10 ~ 15分钟。 


7.显微镜下观察到大部分克隆贴在皿底后将细胞置于37℃恒温CO2细胞培养箱培养。 


8.每天换液直至达到可以传代的标准。细胞冻存 

细胞冻存操作流程: 

1.配制冻存液:90% 人多潜能干细胞完全培养基+10% DMSO;将人多潜能干细胞完全培养基取出并平衡至室温。 

2.吸走待传代细胞培养皿/瓶中的人多潜能干细胞完全培养基,并且加入无钙镁的PBS溶液洗一

次。 

3.加入人多潜能干细胞消化液使之完全覆盖皿/瓶底。 


4.37℃恒温CO2细胞培养箱中孵育4 ~ 6分钟,显微镜下观察到大部分克隆边缘开始脱离皿/瓶底,克隆内


部大部分细胞间出现较为明显的间隙,肉眼观察到细胞集落变得不透明且发白,表明细胞消化时间理想。 

5.吸去消化液,即刻加入冻存液,用移液器扇形吹打培养皿/瓶底,使皿/瓶底贴附的干细胞集落脱落, 轻柔缓慢吹吸混匀。 

注:吹吸的力度要轻柔,吹打脱落和吹吸混匀的次数总共不超过10次为宜。吹打过度导致大量单细胞出现是造成细胞分化或死亡的重要原因。 

注:如有少量细胞无法从皿底脱落,属于正常现象。如有大量细胞无法从皿底脱落,需延长消化时间。 


6.按照复苏所需要的量,1 ~ 5×106/mL,每管1mL冻存。 


7.以1℃每分钟的速率降至-80℃过夜(一般常见商品化程序降温盒均可提供此条件)。 


8.-80℃过夜后,将冻存细胞转移至液氮保存。细胞复苏 

细胞复苏操作流程:  

1.将人多潜能干细胞复苏完全培养基取出并平衡至室温;取出包被过人多潜能干细胞铺底工作液的培养皿/瓶,吸去包被液并加入适量人多潜能干细胞复苏完全培养基,置于37℃ 恒温CO2细胞培养箱中。 

2.37℃水浴解冻细胞,小心摇晃使细胞融化至仅剩一小块冰晶,迅速取出并用75%酒精消毒冻存管外表面,转移至无菌操作台中。 

3.将细胞悬液转移至新的15mL离心管中,缓慢加入4mL 人多潜能干细胞完全培养基,轻柔吹吸2 次混匀。 

4.200g离心5分钟。 

5.弃上清,加入适量人多潜能干细胞复苏完全培养基重悬细胞,轻柔吹吸2次混匀,并接种到准备好的培养皿中,显微镜下观察细胞呈4 ~ 10个细胞大小的团块。 

6.水平十字摇匀,于室温放置10 ~ 15分钟。显微镜下观察到大部分克隆贴在皿底后,37℃恒温CO2细胞


培养箱中培养24小时。 

7.弃掉人多潜能干细胞复苏完全培养基,加入新鲜的人多潜能干细胞完全培养基继续培养,每天更换新鲜的人多潜能干细胞完全培养基。 

疑难解答: 


细胞复苏率低是什么原因? 


细胞复苏需使用人多潜能干细胞复苏培养基,可大大提高细胞的复苏效率。复苏过程中,转移细胞、吹打混匀和重悬细胞时,吹打力度要轻柔,并尽量减少吹打次数,细胞接种后,即刻在镜下观察

细胞团块的大小,4 ~ 10个细胞的团块为最佳。如果吹打力度过大或次数过多,导致细胞分散成单细胞,


细胞复苏率将偏低。 


培养基中有沉淀状物质是否是质量问题? 

添加剂在解冻过程中,会有少量沉淀析出,属于正常现象,不影响使用,请充分混匀后与基础培养基混合。但添加剂不能在37℃解冻,否则会析出大量沉淀,影响培养基的效价。如果培养基中出现大量沉淀, 请不要使用。 

是否能在37℃反复水浴完全培养基? 

不推荐。频繁地在4℃和37℃之间转换会导致完全培养基中含有的因子失活,完全培养基在使用前放置至室温即可。 

是否能用dispase酶或者胶原酶进传代? 

在培养体系中培养的人iPSC需用非酶的温和消化方式传代,用dispase酶或者胶原酶消化细胞会对细胞造成伤害,影响传代后细胞的存活率和贴壁率。 

细胞消化后成了单细胞是什么原因? 

人iPSC消化成小克隆(4个以上20个以下的细胞聚集)进行传代最为适宜,消化为单细胞会短暂影响细胞的状态。造成细胞消化成单细胞的原因有: 

1.人多潜能干细胞消化液消化过度,需减短消化时间; 

2.对细胞悬液吹吸的力度过重,或次数过多,需缓慢吸液与吹液,每皿/瓶的吹吸次数控制在10次以下。 

人ESC/iPSC在传代后不贴壁怎么解决? 

造成人ESC/iPSC传代后不贴壁的最可能的原因: 


1.细胞消化时间不合适; 


2.消化后吹打次数不合适,使得完成传代后细胞集落过大或过小; 


3.消化时间不合适,把细胞强行吹打下来。 


人ESC/iPSC分化怎么处理? 

1.细胞在刚复苏或传代时,小的细胞团不呈现标准的克隆形态,培养几天或传代后可恢复; 


2.如果人ESC/iPSC分化的表现为干细胞克隆形态良好,克隆周边出现散在的分化细胞,可通过高比例传代(≥1:6),使得分化细胞的密度减少,低密度的分化细胞可被培养体系筛选去除, 如未完全去除,可用细胞刮或巴斯德管刮除; 


3.如果人ESC/iPSC分化的表现为克隆内部松散,边缘不平滑,在分化比例小或分化不严重的情况下, 可通过连续传代2 ~ 3次恢复,如果分化严重,建议弃除。 


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