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人鞭毛蛋白(flagellin)ELISA试剂盒说明书

 发布时间:2015-08-05 点击量:211

  
  本试剂仅供研究使用目的:本试剂盒用于测定人血清,血浆及相关液体样本中鞭毛蛋白(flagellin)的含量。
  
  人鞭毛蛋白(flagellin)ELISA试剂盒说明书组成 48孔配置 96孔配置 保存
  说明书 1份 1份
  封板膜 2片(48) 2片(96)
  密封袋 1个 1个
  酶标包被板 1×48 1×96 2-8℃保存
  标准品:72ng/ml 0.5ml×1瓶 0.5ml×1瓶 2-8℃保存
  标准品稀释液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶 2-8℃保存
  酶标试剂 3ml×1瓶 6ml×1瓶 2-8℃保存
  样品稀释液 3ml×1瓶 6ml×1瓶 2-8℃保存
  显色剂A液 3ml×1瓶 6ml×1瓶 2-8℃保存
  显色剂B液 3ml×1瓶 6ml×1瓶 2-8℃保存
  终止液 3ml×1瓶 6ml×1瓶 2-8℃保存
  浓缩洗涤液 (20ml×20倍)×1瓶 (20ml×30倍)×1瓶 2-8℃保存
  
  人鞭毛蛋白(flagellin)ELISA试剂盒说明书样本处理及要求:
  1.血清:室温血液自然凝固10-20分钟,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清,保存过程中如出现沉淀,应再次离心。
  2.血浆:应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂,混合10-20分钟后,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应该再次离心。
  3.尿液:用无菌管收集,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。
  4.细胞培养上清:检测分泌性的成份时,用无菌管收集。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。检测细胞内的成份时,用PBS(PH7.2-7.4)稀释细胞悬液,细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融,以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。
  5.组织标本:切割标本后,称取重量。加入一定量的PBS,PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS(PH7.4),用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。分装后一份待检测,其余冷冻备用。
  6.标本采集后尽早进行提取,提取按相关文献进行,提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验,可将标本放于-20℃保存,但应避免反复冻融.
  7.不能检测含NaN3的样品,因NaN3抑制辣根过氧化物酶的(HRP)活性。
  操作步骤
  1.标准品的稀释与加样:在酶标包被板上设标准品孔10孔,在*、第二孔中分别加标准品100μl,然后在*、第二孔中加标准品稀释液50μl,混匀;然后从*孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔,再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl,混匀;然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉,再各取50μl分别加到第五、第六孔中,再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul,混匀;混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中,再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl,混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中,再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl,混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。(稀释后各孔加样量都为50μl,浓度分别为48ng/ml,32ng/ml,16ng/ml,8ng/ml,4ng/ml)。
  2.加样:分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液50μl,然后再加待测样品10μl(样品终稀释度为6倍)。加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀。
  3.温育:用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
  4.配液:将30(48T的20倍)倍浓缩洗涤液用蒸馏水30(48T的20倍)倍稀释后备用。
  5.洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30秒后弃去,如此重复5次,拍干。
  6.加酶:每孔加入酶标试剂50μl,空白孔除外。
  7.温育:操作同3。
  8.洗涤:操作同5。
  9.显色:每孔先加入显色剂A50μl,再加入显色剂B50μl,轻轻震荡混匀,37℃避光显色15分钟.
  10.终止:每孔加终止液50μl,终止反应(此时蓝色立转黄色)。
  11.测定:以空白空调零,450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。
  注意事项:
  1.试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用,酶标包被板开封后如未用完,板条应装入密封袋中保存。
  2.浓洗涤液可能会有结晶析出,稀释时可在水浴中加温助溶,洗涤时不影响结果。
  3.各步加样均应使用加样器,并经常校对其准确性,以避免试验误差。一次加样时间控制在5分钟内,如标本数量多,推荐使用排枪加样。
  4.请每次测定的同时做标准曲线,做复孔。如标本中待测物质含量过高(样本OD值大于标准品孔*孔的OD值),请先用样品稀释液稀释一定倍数(n倍)后再测定,计算时请后乘以总稀释倍数(×n×6)。
  5.封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。
  6.底物请避光保存。