欢迎进入上海语燕生物技术有限公司!
技术文章
首页 > 技术文章 > 植物细胞色素C释放凋亡检测试剂盒产品说明书

植物细胞色素C释放凋亡检测试剂盒产品说明书

 发布时间:2015-09-15 点击量:183

主要用途

植物细胞色素C释放凋亡检测试剂是一种旨在从植物细胞或活体组织中分离出线粒体和细胞浆组分,从而检测细胞色素C的转运,即由线粒体释放到细胞浆,来探测细胞凋亡的而经典的技术方法。该技经过精心研制、成功实验证明的。适合于各种新鲜植物组织,包括叶片(leaf)、谷粒(grain)、种子(seed)、以及培养细胞等的线粒体和细胞浆组分的制备。可以被用于后续蛋白质西方杂交等实验。产品不含污染性蛋白水解酶和核酶,即到即用,性能稳定。

技术背景

细胞色素C(CYTOCHROME C)在细胞凋亡中扮演着重要作用。细胞色素C位于线粒体内外膜之间。当细胞凋亡时,它从线粒体内释放到细胞浆里,引起一系列的信号通道的下游反应。

产品内容

清理液(Reagent A)   毫升

裂解液(Reagent B)   毫升

净化液(Reagent C)   毫升

强化液(Reagent D)   毫升

保存液(Reagent E)   毫升

活性液(Reagent F)   微升

溶解液(Reagent G)   毫升

上样液(Reagent H)   微升

产品说明书        1

保存方式

保存活性液(Reagent F)在-20冰箱里, 避免反复冻融;其余的保存在4冰箱里有效保证6月

用户自备

15毫升锥形离心管:用于样品操作的容器

50毫升锥形离心管:用于样品操作的容器

1.5毫升离心管:用于样品操作的容器

4℃(微型)台式离心机:用于样品操作

DOUNCE匀浆器:用于裂解植物组织细胞

抗细胞色素C抗体:用于蛋白质西方杂交

实验步骤

  • 植物组织线粒体分离(组织匀浆法)

实验开始前,将试剂盒里的净化液(Reagent C活性液(Reagent F)冻融,然后分别移出xx毫升净化液(Reagent C和xx微升活性液(Reagent F)xx毫升的裂解液(Reagent B里,混匀后,放进冰槽里,标记为裂解工作液。然后进行下列操作。


  • 准备好新鲜的植物组织(叶片、谷粒、种子等),并秤重以确定1克组织重量 
  • (选择步骤)放进预冷的50毫升锥形离心管
  • (选择步骤)加入xx毫升清理液(Reagent A清洗2
  • 即刻用刀片切碎组织
  • 放进一个预冷的15毫升锥形离心管
  • 加入预冷的xx毫升裂解工作液
  • 涡旋震荡5秒,充分混匀
  • 即刻放进预冷的DOUNCE匀浆器,在冰槽里用研磨棒匀化组织(约80下)(注意:参见注意事项6
  • 将所有组织匀浆物移入15毫升锥形离心管,放进4台式离心机离心10分钟,速度为1500g
  • 小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除细胞壁、淀粉颗粒、细胞核和未溶解的细胞以及质体等残渣
  • 放进4台式离心机离心10分钟,速度为10000g
  • 小心移取上清液到新的预冷的15毫升锥形离心管――此步骤获得细胞浆组分
  • 放进-70℃冰箱里
  • 保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物
  • 加入xx微升溶解液(Reagent G到线粒体颗粒样品中
  • 涡旋震荡15秒
  • 放进冰槽中孵育15分钟
  • 涡旋震荡60秒
  • 放进4微型台式离心机离心2分钟,速度为13000RPM(16000g,例如eppendorf 5405R)
  • 小心移取上清液到新的1.5毫升离心管――此为所有可溶性线粒体蛋白系统
  • 若暂时不予后续处理,保存在-70冰箱里
  • 或继续进行下列操作

操作一、可溶性线粒体和细胞浆总蛋白定量检测

  • 分别移取10微升线粒体和细胞浆组分进行蛋白定量检测(注意:建议使用Bradford蛋白质浓度定量试剂盒30030.1


操作二、可溶性线粒体和细胞浆蛋白电泳

  • 分别移取20微克线粒体和细胞浆蛋白液到新的1.5毫升离心管
  • 加入xx微升上样液(Reagent H)
  • 涡旋震荡15秒
  • 放进台式微型离心机离心10秒,速度为2000RPM(400g,例如eppendorf 5405R)
  • 煮沸5分钟
  • 上样,进行电泳操作(12%SDS-PAGE)
  • 使用1微克/毫升抗细胞色素C抗体进行西方杂交(注意:建议使用蛋白质西方杂交印迹(化学发光)试剂盒30005.1
  • 比较细胞色素C的浓度变化和差异
  • 植物组织线粒体分离(化学处理法)

实验开始前,将试剂盒里的净化液(Reagent C活性液(Reagent F)冻融,然后分别移出xx毫升净化液(Reagent C和xx微升活性液(Reagent F)xx毫升的裂解液(Reagent B里,混匀后,放进冰槽里,标记为裂解工作液。然后进行下列操作。


  • 准备好新鲜的植物组织(叶片、谷粒、种子等),并秤重以确定1克组织重量 
  • (选择步骤)放进预冷的50毫升锥形离心管
  • (选择步骤)加入xx毫升清理液(Reagent A)清洗2次
  • 移入一个液氮冻存管
  • 即刻放进液氮罐过一晚
  • 次日从液氮罐里取出,即刻(快速度)碾碎组织成粉末(注意:切莫使组织冻融
  • 放进一个15毫升锥形离心管
  • 加入预冷的xx毫升裂解工作液
  • 涡旋震荡5秒,充分混匀
  • 在冰槽里孵育2分钟,期间涡旋震荡5秒一次
  • 加入预冷的xx微升强化液(Reagent D)
  • 涡旋震荡5秒,充分混匀
  • 在冰槽里孵育5分钟,期间涡旋震荡5秒二次(注意:参见注意事项7
  • 加入预冷的5毫升保存液(Reagent E),轻轻摇动试管混匀
  • 放进4台式离心机离心10分钟,速度为1500g
  • 小心移出上清液到另一个新的预冷的15毫升锥形离心管——此步骤去除细胞壁、淀粉颗粒、细胞核和未溶解的细胞以及质体等残渣
  • 放进4台式离心机离心10分钟,速度为10000g
  • 小心移取上清液到新的预冷的15毫升锥形离心管――此步骤获得细胞浆组分
  • 放进-70℃冰箱里
  • 保留沉淀颗粒——此步骤获得线粒体沉淀物
  • 加入xx微升溶解液(Reagent G)到线粒体颗粒样品中
  • 涡旋震荡15秒
  • 放进冰槽中孵育15分钟
  • 涡旋震荡60秒
  • 放进4℃微型台式离心机离心2分钟,速度为13000RPM(16000g,例如eppendorf 5405R)
  • 小心移取上清液到新的1.5毫升离心管――此为所有可溶性线粒体蛋白系统
  • 若暂时不予后续处理,保存在-70℃冰箱里
  • 或继续进行下列操作