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革兰氏细菌的细胞壁常见使用心得

 发布时间:2016-01-18 点击量:854

革兰氏细菌的细胞壁的小知识

成分

占细胞壁干重的%

革兰氏阳性细菌

革兰氏阴性细菌

肽聚糖

含量很高(50~90)

含量很低(~10)

磷壁酸

含量较高(<50)

类脂质

一般无(<2)

含量较高(~20)

蛋白质

含量较高

1、革兰氏阳性细菌的细胞壁

革兰氏阳性细菌细胞壁的特点是厚度大(20~80nm)和化学组分简单,一般只含90%肽聚糖和10%磷壁酸。

革兰氏阳性菌——金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)具典型的肽聚糖,它的肽聚糖厚约20~80nm,由40层左右的网格状分子交织成的网套覆盖在整个细胞上。肽聚糖分子是由肽与聚糖两部分组成,其中的肽有四肽尾和肽桥两种,聚糖则由N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸相互间隔连接而成,呈长链骨架状。看似复杂的肽聚糖分子,若把它的基本组成单位剖析一下,就显得十分简单了。每一肽聚糖单体由三部分组成:

①双糖单位:由一个N-乙酰葡糖胺通过β-1,4-糖苷键与另一个N-乙酰胞壁酸相连,后者为原核生物所特有的已糖。这一双糖单位中的β-1,4-糖苷键很容易被一种广泛分布于卵清、人的泪液和鼻涕以及部分细菌和噬菌体中的溶菌酶(lysozyme)所水解(水解位点在N-乙酰胞壁酸的1碳和N-乙酰葡糖胺的4碳间),从而引起细菌因肽聚糖细胞壁的“散架”而死亡。

②四肽尾或四肽侧链(tetrapeptide side chain):是由四个氨基酸分子按L型与D型交替方式连接而成。在金黄色葡萄球菌中,接在N-乙酰胞壁酸上的四肽尾为L-ala →D-glu → L-lys → D-ala,其中两种D型氨基酸在细菌细胞壁之外很少出现。

③肽桥或肽间桥(peptide interbridge):在金黄色葡萄球菌中,肽桥为甘氨酸五肽,它起着连接前后两个四肽尾分子的“桥梁”作用。目前所知的肽聚糖已超过100种,在这一“肽聚糖的多样性”中,主要的变化发生在肽桥上。

(2)磷壁酸(teichoic acid)

是结合在革兰氏阳性细菌细胞壁上的一种酸性多糖,主要成分为甘油磷酸或核糖醇磷酸。磷壁酸可分两类,其一为壁磷壁酸,它与肽聚糖分子间进行共价结合,含量会随培养基成分而改变,一般占细胞壁重量的10%,有时可接近50%。用稀酸或稀碱可以提取。其二为跨越肽聚糖层并与细胞膜相交联的膜磷壁酸(又称脂磷壁酸),由甘油磷酸链分子与细胞膜上的磷脂进行共价结合后形成。其含量与培养条件关系不大。可用45%热酚水提取,也可用热水从脱脂的冻干细菌中提取。磷壁酸有五种类型,主要为甘油磷壁酸和核糖醇磷壁酸两类,前者在干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)等细菌中存在,后者在金黄色葡萄球菌和芽孢杆菌属(Bacillus)等细菌中存在。

2、革兰氏阴性细菌的细胞壁

(1)肽聚糖

革兰氏阴性细菌的肽聚糖可举大肠杆菌为代表。它的肽聚糖埋藏在外膜层之内,是仅由1~2层肽聚糖网状分子组成的薄层(2~3nm),含量约占细胞壁总重的10%,故对机械强度的抵抗力较革兰氏阳性菌弱。其结构单体与上述革兰氏阳性菌基本相同,差别仅在于:

①四肽尾的第3个氨基酸不是L-lys,而是被一种只有在原核微生物细胞壁上才有的内消旋二氨基庚二酸(m-DAP)所代替;

②没有特殊的肽桥,其前后两个单体间的连接仅通过甲四肽尾的第4个氨基酸——D-ala的羧基与乙四肽尾的第3个氨基酸——mDAP的氨基直接相连,因而只形成较为疏稀、机械强度较差的肽聚糖网套

(2)外膜(outer membrane)

位于革兰氏阴性细菌细胞壁外层,由脂多糖、磷脂和脂蛋白等若干种蛋白质组成的膜,有时也称为外壁。

脂多糖(lipopolysaccharide, LPS):是位于革兰氏阴性细菌细胞壁外层的一层较厚(8~10nm)的类脂多糖类物质,由类脂A、核心多糖(core polysaccharide)和O-特异侧链(O-specific side chain,或称O-多糖或O-抗原)三部分组成。其主要功能为:

①其中的类脂A是革兰氏阴性细菌致病物质——内毒素的物质基础;

②因其负电荷较强,故与磷壁酸相似,也有吸附Mg2+、Ca2+等阳离子以提高其在细胞表面浓度的作用;

③由于LPS结构的多变,决定了革兰氏阴性细菌细胞表面抗原决定簇的多样性,例如,根据LPS抗原性的测定,上已报道过的沙门氏菌属(Salmonella)的抗原型多达2107种(1983年);

④是许多噬菌体在细胞表面的吸附受体;

⑤具有控制某些物质进出细胞的部分选择性屏障功能,例如,它可透过若干种较小的分子(嘌呤、嘧啶、双糖、肽类和氨基酸等),但能阻拦溶菌酶、抗生素(青霉素等)、去污剂和某些染料等较大分子进入细胞膜。要维持LPS结构的稳定性,必须有足够的2+存在。如果用EDTA等螯合剂去除Ca2+和降低离子键,就会使LPS解体。这时,其内壁层的肽聚糖分子就会暴露出来,因而易被溶菌酶所水解。

 

在LPS中,类脂A的种类较少(大约有7~8种),它是革兰氏阴性细菌内毒素的物质基础。 在LPS的核心多糖区和O-特异侧链区中有几种独特的糖,例如2-酮-3-脱氧辛糖酸(KDO)、L-甘油-D-甘露庚糖和阿比可糖(Abq, 即3,6-二脱氧-D-半乳糖)。在沙门氏菌中,LPS中的O-特异侧链种类极多,因其抗原性的差异故很易用灵敏的血清学方法加以鉴定,这在传染病的诊断中有其重要意义,例如由此可对某传染病的传染原进行地理定位等。

(3)外膜蛋白(outer membrane protein)

指嵌合在LPS和磷脂层外膜上的蛋白。有20余种,但多数外膜蛋白的功能还未清楚。其中的脂蛋白(lipoprotein)是一种通过共价键使外膜层牢固地连接在肽聚糖内壁层上的蛋白,分子量约为7200。另有两种蛋白研究得较为清楚,都称孔蛋白(porins)。每个孔蛋白分子是由三个相同分子量(36000)蛋白亚基组成的一种三聚体跨膜蛋白,中间有一直径约1nm的孔道,通过孔的开、闭,可阻止某些抗生素进入外膜层。已知有两种孔蛋白,其一是非特异性孔蛋白(nonspecific porin),其充水孔道可通过分子量小于800~900的任何亲水性分子,如双糖、氨基酸、二肽和三肽;另一为特异性孔蛋白(specific porin或specific channel protein),其上存在专一性结合位点,只容许一种或少数几种相关物质通过,其中大的孔蛋白可通过分子量较大的物质,如维生素B12和核苷酸等。除脂蛋白和孔蛋白外,还有一些外膜蛋白与噬菌体的吸附或细菌素的作用有关。

(4)周质空间(periplasmic space, periplasm)

又称壁膜间隙。在革兰氏阴性细菌中,一般指其外膜与细胞膜之间的狭窄空间(宽约12~15nm),呈胶状。在周质空间中,存在着多种周质蛋白(periplasmic proteins),包括:

①水解酶类,例如蛋白酶、核酸酶等;

②合成酶类,例如肽聚糖合成酶;

③结合蛋白(具有运送营养物质的作用);

④受体蛋白(与细胞的趋化性相关)。周质蛋白可通过渗透休克法(osmotic shock)或称“冷休克”的方法释放。此法系根据突然改变渗透压并使细胞发生物理性裂解的原理。其主要步骤是:将细菌放在用Tris缓冲液配制、含EDTA的20%蔗糖溶液中保温,使其发生质壁分离(plasmolysis),接着快速地用4℃的0.005mol/L MgCl2溶液稀释并降温,使细胞外膜突然破裂并释放周质蛋白。经离心即可从上清液中提取周质蛋白。

革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌间由于细胞壁和其他构造的不同,就产生了一系列形态、构造、化学组分、染色反应、生理功能和致病性等的差别,这些差别对微生物学的研究和实际应用都十分重要,现列表如下

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